Laboratoř in situ hybridizace

Laboratoř in situ hybridizace vznikla na pracovišti Ústavu patologie a molekulární medicíny 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole v roce 1998.

Laboratoř se zabývá problematikou nádorových onemocnění dětí a dospělých. Stěžejní vyšetřovací metodou je metoda fluorescenční in situ hybridizace na interfázických jádrech (I-FISH) a specializovaná imunohistochemická vyšetření navazující na rutinní laboratoř imunohistochemie. Laboratoř disponuje moderním přístrojovým vybavením. Pro hodnocení I-FISH se používají dva fluorescenční mikroskopy – Provis AX70 (Olympus) a Axioplan 2 (Carl Zeiss). Mikroskop Axioplan 2 je vybaven modulem ApoTome (Carl Zeiss).

Činnost Laboratoře in situ hybridizace je hrazena z prostředků výzkumných záměrů a grantových projektů.

Vyšetřovaný materiál

Hlavním typem vyšetřovaného materiálu jsou histologické řezy z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání. Vyšetření histologického řezu umožňuje morfologickou orientaci ve tkáni. Na základě morfologické znalosti tkáně (výhoda začlenění laboratoře I-FISH na pracovišti patologie) lze odlišit nádorovou populaci od populace nenádorové. Vyšetření histologického řezu také umožňuje korelaci výsledku I-FISH s výsledky imunohistochemickými (zjištění exprese proteinů in situ v tkáni). V neposlední řadě lze pro I-FISH použít archivní parafinové bloky. Nevýhodou vyšetření histologických řezů je odkrojení části jader při přípravě histologického řezu – krájení na mikrotomu. Vyšetření není vhodné pro sledování minimální residuální choroby.

Dalším typem vyšetřovaného materiálu jsou otiskové preparáty z nativní tkáně. Výhodou vyšetření I-FISH na otiskovém preparátu je zachování celého objemu jádra. Nevýhodou je ztráta morfologie vyšetřované tkáně a časově omezená trvanlivost preparátu. Obdobným způsobem jako otiskové preparáty lze vyšetřit také cytospinové preparáty buněčných tekutin.

Prováděná vyšetření

V laboratoři používáme přímo značené sondy (Vysis / Abbott). Tyto sondy lze použít na jádra v interfázi. Ve srovnání s např. leukemickými buňkami (pomocí FISH se vyšetřují hlavně na metafázických chromosomech), jsou solidní nádory obtížně kultivovatelné. Kvalita získaných chromosomů není optimální a v průběhu dlouhodobé kultivace se může měnit zastoupení buněk, které nemusí v konečné fázi dobře reprezentovat složení nádoru. Často kultury přerostou buňkami nenádorovými. Z tohoto důvodu se v naší laboratoři pracuje s jádry v interfázi.

Pomocí lokus specifických sond vyšetřujeme amplifikace genů, delece chromosomálních oblastí, chromosomální translokace a zlomy. Pomocí sond centromerických lze zjistit počet chromosomů. Hodnotíme buď počet signálů (např. amplifikace genů, počet chromosomů), nebo jejich uspořádání v interfázických jádrech (např. translokace nebo chromosomální zlomy).

V tabulce je uveden přehled vyšetření prováděných v naší laboratoři. Některá z níže uvedených vyšetření se používají pro diagnózu onemocnění – chromosomální změna je pro onemocnění charakteristická (např. lymfom z buněk pláště a t(11;14)).

V některých případech pomůže vyšetření odlišit dvě formy nádoru (např. rabdomyosarkom – alveolární se zlomy v oblasti FKHR, embryonální bez zlomu).

Stanovení amplifikace genu ERBB2 u nemocných s karcinomy mléčné žlázy slouží, společně se stanovením exprese proteinu ERBB-2, pro indikaci k terapii humanizovanou protilátkou Herceptinem.

V jiných případech se používá stanovení zlomu určité chromosomální oblasti jako „screeningové“ pro následné vyšetření metodami molekulárními (např. stanovení zlomu ALK genu u velkobuněčných anaplastických lymfomů).

V některých případech má vyšetření chromosomálních změn přínos prognostický. Metodu I-FISH lze s výhodou také použít pokud není kvalita formolem fixované tkáně dostatečná pro izlolace nukleových kyselin pro metody molekulární.
 

 

 

Pro ilustraci uvádíme ukázky výsledku vyšetření metodou I-FISH na histologických řezech z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání.
 

Příklady výsledků I-FISH na histologických řezech z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání: A) lymfom z buněk pláště – t(11;14) – dva fúzní zeleno-žluto-červené signály v jádrech nádorových buněk; B) velkobuněčný anaplastický lymfom – zlom 2p23 – oddálené zelené a červené signály v jádrech nádorových buněk; C) karcinom mléčné žlázy – amplifikace genu ERBB2 (červené signály), 2–3 zelené signály (centromera chromosomu 17)

 

Z publikační činnosti Laboratoře in situ hybridizace:

Publikace zahraniční

Mrhalová M, Kodet R (2006) A modified approach for I-FISH evaluation of ERBB2 (HER-2) gene copy numbers in breast carcinomas: comparison with HER-2/CEP17 ratio system. J Cancer Res Clin Oncol. Dec 13; [Epub ahead of print]
 
Stejskalová E, Jarošová M, Kabíčková E, Šmelhaus V, Mrhalová M, Kodet R (2006) Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma with a der(14)t(8;14)(q24;q32) and a translocation of MYC to the derivative chromosome 14 with a deleted IGH locus. Cancer Genetics and Cytogenetics Oct 15; 170(2): 158–162
 
Krsková L, Mrhalová M, Sumerauer D, Kodet R (2006) Rhabdomyosarcoma: molecular diagnostics of patients classified by morphology and immunohistochemistry with emphasis on bone marrow and purged peripheral blood progenitor cells involvement. Virchows Archiv Apr, 448(4): 449–458
 
Mrhalová M, Plzák J, Betka J, Kodet R (2005) Epidermal growth factor receptor – its expression and copy numbers of EGFR gene in patients with head and neck squamous cell carcinomas. Neoplasma 52(4): 338–343
 
Mrhalová M, Kodet R (2003) Paget’s disease of the nipple: a copy number of the genes ERBB2 and CCND1 versus expression of the proteins ERBB-2 and cyclin D1. Neoplasma 50(6): 396–402
 
Mrhalová M, Kodet R, Kalinová M, Hilská I (2003) Relative quantification of ERBB2 mRNA in invasive duct carcinoma of the breast: correlation with the ERBB-2 protein expression and the ERBB2 gene copy number. Pathology – Research and Practice 199: 453–461
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Campr V, Neškudla T, Szépe P, Plank L (2003) Mantle cell lymphoma: improved diagnostics using a combined approach of immunohistochemistry and identification of t(11;14)(q13;q32) by polymerase chain reaction and fluorescence in situ hybridization. Virchows Archiv 442: 538–547

Abstrakta v mezinárodních časopisech

Krsková L, Hilská I, Augustiňáková A, Kalinová M, Mrhalová M, Neradová M, Kodet R (2006) Expression of ERBB2 and BCL-2 in synovial darcoma. XXVI Congress of the International Academy of Pathology, 16.–21.9.2006Montreal Kanada. Modern Pathology 19 (3), p.181
 
Mrhalová M, Plzák J, Betka J, Kodet R (2005) Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC): Epidermal growth factor receptor (EGFR) protein expression and EGFR gene copy numbers. 20th European Congress of Pathology, 3.–8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 411, P 566; Sdělení bylo vyhodnoceno jako nejlepší poster kongresu.
 
Mrhalová M, Neradová M, Kodet R (2005) A modified approach for evaluation of ERBB2 (HER2) gene copy number in moderately amplified invasive duct carcinomas (IDC) of the breast. 20th European Congress of Pathology, 3.–8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 363, P 413
 
Campr V, Mrhalová M, Neradová M, Pytlík R (2005) Immunohistochemical detection of STAT1 and TRAF1 in mediastinal large B-cell lymphoma. 20th European Congress of Pathology, 3.–8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 265, P 113
 
Soukup J, Campr V, Manďáková P, Krsková L, Kalinová M, Mrhalová M, Kodet R (2004) Malignant lymphoma as a part of multiple primary tumors. XII. Meeting of the European Association for Haemathopathology, 26.9.–1.10.2004
 
Mrhalová M, Kalinová M, Krsková L, Soukup J, Kodet R (2003) Monitoring of patients with follicular lymphoma carrying t(14;18)(q32;q21) by real time quantitative PCR. 19th European Congress of Pathology, 6.–11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 405, P-349
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Campr V, Szepe P, Plank L, Kubáčková K (2003) Mantle cell lymphoma (MCL): Ki-67 antigen and chromosome 12 ploidy in an estimate of the tumor progression. 19th European Congress of Pathology, 6.–11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 407, P-353
 
Mrhalová M, Kalinová M, Kodet R (2002) Quantitative RT-PCR as a tool solving discrepant results between ERBB2 gene copy numbers and expression of the ERBB-2 protein: An improvement of Herceptin therapy indication in breast carcinomas. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.–10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 3, O.01.216
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Kabíčková E (2002) Burkitt´s lymphoma (BL): fluorescence in situ hybridization (FISH) on interphasic nuclei as a tool to reveal specific translocations, PCR detection of clonality and bone marrow (BM) involvement. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.–10.10.2002 Amsterodam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 91, P.03.201
 
Soukup J, Krsková L, Mrhalová M, Kodet R, Campr V, Kubáčková M, Trněný M (2002) Diffuse large B cell lymphomas (DLBCL): analysis of the heterogeneous group by means of immunohistochemistry, PCR and FISH. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.–10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 15, O.03.366
 
Mrhalová M, Kodet R, Neradová M (2001) Paget’s disease of the breast – copy numbers of c-erbB-2, CCND1 and TP53 genes (FISH), expression of their protein products (IHC). 18th European Congress of Pathology, 8.–13.9.2001 Berlin Germany. Virchows Archiv 439 (3): 445–446, P-49
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Szépe P (2001) Mantle cell lymphoma (MLC): A combined immunohistochemical (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) and PCR study. 18th European Congress of Pathology, 8.–13.9.2001 Berlin Germany. Virchows Archiv 439 (3): 417, P-459
 
Kodet R, Mrhalová M, Soukup J, Michal M, Dvořák K, Plank L (2000) Anaplastic large cell lymphoma (ALCL): Immunohistochemical analysis with the assessment of the translocation of the ALK gene. XXIII International Congress of the International Academy of Pathology, 15.–20.10.2000 Nagoya Japan. Pathology International 50 (suppl): A143, P-17–103
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2000) Amplification of c-erbB-2 and CCND1 genes in breast carcinomas (FISH) compared with expression of c-erbB-2 and cyclin D1 proteins (IHC). XXIII International Congress of the International Academy of Pathology, 15.–20.10.2000 Nagoya Japan. Pathology International 50 (suppl): A39, P-18–67
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (1999) C-erbB-2 oncogene expression detected by FISH in correlation with membrane expression of c-erbB2 oncoprotein in patients with breast carcinomas. 17th European Congress of Pathology, 18.–23.9.1999 Barcelona Spain. Virchows Archiv 435 (3): 198, P-023

Publikace domácí

Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Manďáková P, Kalinová M (2004) Život patologa mezi molekulami – výstroj a výzbroj pro přežití. Klinická onkologie 17 (1): 3–8
 
Mrhalová M, Krsková L, Kalinová M, Soukup J, Kodet R (2003) Folikulární lymfomy: molekulární diagnostika t(14;18)(q32;q21) – fluorescenční in situ hybridizace, kvalitativní a kvantitativní PCR. Česko-slovenská patologie 39 (3): 130–137
 
Soukup J, Krsková L, Mrhalová M, Kodet R, Campr V, Kubáčková K, Trněný M (2003) Velkobuněčné difúzní Blymfomy: heterogenní původ a prognóza z hlediska současné diagnostiky. Časopis lékařů českých 142 (7): 417–422
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Stejskalová E (2003) Anaplastický velkobuněčný lymfom: přehled problematiky. Česko-slovenská patologie 39 (3): 102–114
 
Dvořáčková J, Uvírová M, Kerlínová V, Kodet R, Mrhalová M (2002) Imunohistochemický (IHC) průkaz HER2 proteinu a jeho hodnocení u nemocných s karcinomy mléčné žlázy: Srovnávací studie dvou pracovních postupů (HercepTest DAKO versus běžný IHC postup s polyklonální protilátkou DAKO) a výsledků dvou pracovišť. Česko-slovenská patologie 38 (suppl S1): 20–26
 
Mrhalová M, Kodet R (2002) Indikace k léčbě nemocných s invazivními duktálními karcinomy mléčné žlázy Herceptinem z pohledu laboratorní diagnostiky – vyšetření ERBB-2 proteinu a stanovení počtu kopií ERBB2 genu. Přehled problematiky. Česko-slovenská patologie 38 (suppl S1): 4–14
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2002) Invazivní duktální karcinomy mléčné žlázy: vyšetření počtu kopií genu CCND1 a počtu chromozómů 11 metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) v porovnání s expresí proteinu cyklín D1 a receptoru pro estrogen (ERa) detegovanou imunohistochemicky (IHC). Časopis lékařů českých 141 (22): 708–714
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2001) Korelace exprese c-erbB-2 genu (detekce metodou FISH) s membránovou expresí erbB-2 proteinu (detekce metodou IHC) u pacientek s karcinomy mléčné žlázy. Časopis lékařů českých 140 (18): 553–559
 

KONTAKT:

RNDr. Marcela Mrhalová, Ph.D.
tel: 224435634 (sekretariát ústavu: 224435600); e-mail: @email
 
Laboratoř in situ hybridizace
Ústav patologie a molekulární medicíny
2. LF UK a FN v Motole
V Úvalu 84; 150 06 Praha 5 – Motol
 

V Praze, 28. ledna 2007