Studentská vědecká konference

Abstrakta
 

VÝSLEDKY VYŠETŘENÍ GDAP1 GENU U ČESKÝCH CMT PACIENTŮ S JIŽ VYLOUČENOU NEJČASTĚJŠÍ MUTACÍ
Baránková Lucia, Mikešová Emílie¹, Mazanec Radim, Vondráček Petr²,Seeman Pavel¹. Neurologická klinika dospělých a ¹Dětská neurologická klinika FNM a UK 2. LF, ²Klinika dětské neurologie FN Brno. Školitel doc. MUDr Martin Bojar, CSc.
 
Úvod: Choroby Charcot-Marie-Tooth (CMT) představují skupinu dědičných neuropatií se všemi typy dědičnosti. Podle elektrofyziologického nálezu je možno odlišit axonální typ (CMT2) od demyelinizačního typu (CMT1). Gen kódující GDAP1 (ganglioside-induced differentiation associated protein 1) je jeden ze 6 genů spojených s autosomálně recesivními formami CMT (AR CMT). Dosud bylo popsáno 20 mutací GDAP1 genu u pacientů jak s CMT1 tak s CMT2.
Cíl: Určit frekvenci a spektrum mutací genu GDAP1 u českých CMT pacientů .
Pacienti a metody: Vybrali jsme pacienty z AR rodin a z rodin se sporadickým výskytem neuropatie, jak s axonálním (19 rodin), tak demyelinizačním (16 rodin) a nerozhodnutelným typem neuropatie (9 rodin), se začátkem onemocnění před 10.rokem života. U všech pacientů byla předem vyloučena CMT1A duplikace a HNPP delece. Přímým sekvenováním celé kódující oblasti GDAP1 genu a přilehlých intronových úseků bylo vyšetřeno 45 pacientů ze 44 rodin.
Výsledky: V kódující oblasti genu jsme detekovali dvě různé mutace, již popsanou 715C>T-Leu239Phe a nepopsanou 571C>T-Arg191stop, a to u celkem 4 pacientů ze 3 rodin. U dvou pacientů byly nalezeny obě kauzální mutace v homozygotním (715C>T)+ (715C>T) a složeném heterozygotním stavu (715C>T)+(571C>T). U dvou pacientů sourozenců heterozygotů (571C>T) se nám druhou mutaci použitou metodou nepovedlo identifikovat. U všech se jednalo o axonální typ neuropatie.
Závěr: Mutace v genu GDAP1 jsou významnou příčinou CMT u českých pacientů s časným začátkem onemocnění a axonálním typem neuropatie. Byly prokázány u 6,8 % vybraných rodin bez rozdílu elektrofyziologického fenotypu a u 15,8 % rodin s axonálním typem neuropatie. Popisujeme zde první nálezy mutací v GDAP1 genu u českých CMT pacientů a jejich fenotyp.
Podpořeno z grantu IGA c.1A8254-3 a programu Leonardo da Vinci
 
ROLE GENŮ MODIFIKUJÍCÍCH PRŮBĚH CYSTICKÉ FIBRÓZY (CF) Brázová Jitka, Šišmová Kristýna, Cinek Ondřej ¹, Bartošová Jana ¹, Šedivá Anna.
Ústav imunologie a ¹Pediatrická klinika, UK 2. LF a FN Motol
Školitelka: doc. MUDr. Anna Šedivá, CSc.
E-mail: @email
 
Úvod: CF je závažné AR dědičné onemocnění. Mutace v CFTR genu, jehož produktem je chloridový kanál, vede k poruše iontového transportu na membránách epiteliálních buněk. CF pacienti mají vysokou fenotypickou variabilitu. Vzhledem k roli transformující růstového faktoru beta 1 (TGF-beta 1) v profibrotických procesech jsme se zaměřili na případný vliv genového polymorfismu TGF-beta 1 na fenotyp CF.
Materiál a metody: Vyšetřili jsme genový polymorfismus TGF-beta 1 na kodonech 10 a 25 u 118 CF pacientů a 268 kontrol pomocí metody PCR-ARMS. V supernatantech periferní krve po stilumaci LPS a PHA jsme u 100 CF pacientů a 30 kontrol změřili produkci TGF-beta 1 pomocí ELISA metody. Na závěr jsme získaná data porovnali s funkcí plic (FEV1, MEF50) a klinickým stavem CF pacientů.
Výsledky: U CF pacientů jsme nalezli podobnou frekvenci polymorfismů jako u kontrolní skupiny s výjimkou nižší frekvence T/T homozygotů na pozici+869, kodon 10 (CF 29 %, kontroly 42 %, p < 0.02) a vyšší frekvence G/C heterozygotů na pozici +915, kodon 25 (CF 16 %, kontroly 8 %, p < 0.03). Produkce TGF-beta 1 (ng/ml) měla velký rozptyl u kontrol (3–27) a ještě větší u CF pacientů (3–119). Nekolonizovaní pacienti produkují méně TGF-beta 1, mají lepší funkci plic a lepší stav výživy v porovnání s pacienty chronicky kolonizovanými Pseudomonas aeruginosa. Nejnižší produkci TGF-beta 1 a nejhorší funkci plic mají pacienti kolonizovaní bakteriemi komplexu B.cepacia (p < 0.0015).
Závěr: Žádný z testovaných polymorfismů nebyl spojen se změněnou produkcí TGF-beta 1. Pacienti se velmi liší v produkci tohoto cytokinu bez ohledu na genotyp. Se zhoršenou funkcí plic byly spojeny jak velmi vysoké, tak velmi nízké hladiny TGF-beta 1.
S podporou: NI/7468-3, 310/03/H147
 
INVAZIVNÍ MENINGOKOKOVÉ ONEMOCNĚNÍ – VZTAH PCR DIAGNOSTIKY A KLINICKÉHO PRŮBĚHU ONEMOCNĚNÍ
Bronská E^1,2,3, Džupová O³, Kalmusová J¹, Marešová V², J Křížová P^1
1 SZÚ, NRL pro meningokokové nákazy, Praha, ² Infekční klinika UK 2. LF Fakultní nemocnice Na Bulovce, Praha, ³ Infekční klinika UK 3. LF Fakultní nemocnice Na Bulovce, Praha
Školitel: MUDr. Pavla Křížová, CSc., doc. MUDr. Vilma Marešová, CSc.
 
V České republice je ročně hlášeno v posledních letech kolem 100 případů invazivního meningokokového onemocnění. Celková smrtnost se pohybuje těsně pod 10 %. Perakutní průběh tohoto onemocnění vyžaduje rychlou diagnostiku a včasné zahájení terapie a zabezpečení rizikových kontaktních osob. Od roku 2001 je stále více klinickými pracovišti využívána PCR metoda k rychlému průkazu etiologie onemocnění. PCR metoda je vysoce senzitivní a specifická a umožňuje průkaz Neisseria meningitidis i po zahájení antibiotické terapie. Cílem naší práce bylo zhodnotit úspěšnost různých diagnostických metod používaných v rutinní praxi a na vybrané skupině pacientů studovat vztah závažnosti onemocnění a pozitivity PCR.
Do studie byli zařazeni pacienti hospitalizovaní na infekční klinice pro invazivní meningokokové onemocnění v letech 2002 až 2004. U 37 pacientů, u kterých byla diagnóza potvrzena PCR metodou alespoň v jednom biologickém materiálu, jsme stanovili dynamiku pozitivity PCR. K hodnocení závažnosti onemocnění bylo použito APACHE skóre II. Výsledky byly statisticky analyzovány programem Prism.
Meningokoková DNA byla metodou PCR prokázána v krvi do 5. dne a v likvoru do 7. dne od zahájení antibiotické terapie. Prokázali jsme statisticky významnou pozitivní korelaci mezi závažností onemocnění a délkou přetrvávání pozitivity PCR alespoň v jednom klinickém materiálu (Pearson r = 0,31). Naopak studie neprokázala vztah mezi závažností onemocnění a počtem polymorfonukleárních leukocytů v likvoru. Zaznamenali jsme pozitivní výsledky PCR v likvoru i u pacientů s negativním cytologickým nálezem a septickou formou onemocnění.
 
VLIV REDUKCE TĚLESNÉ HMOTNOSTI U DĚTÍ NA SÉROVÉ HLADINY ADIPONEKTINU
Bronský Jiří^1,2, Pechová Marta², Šrámková Daniela³, Nevoral Jiří¹, Průša Richard^2
1Pediatrická klinika UK 2. LF, ²Ústav klinické biochemie a patobiochemie UK 2. LF, ³Endokrinologický ústav Praha. Školitel: doc. MUDr. Richard Průša, CSc.
 
Úvod: Adiponektin je polypeptidický regulační hormon produkovaný adipocyty. Jeho sérové koncentrace negativně korelují s množstvím tukové tkáně organismu. Na základě předchozích studií se předpokládá jeho účast na udržení insulinové senzitivity. Měřili jsme sérové hladiny adiponektinu, insulinu a C-peptidu a antropometrické parametry u obézních dětí před a po 5 týdenní redukci hmotnosti.
Metody: Měřili jsme sérové hladiny adiponektinu s využitím ELISA kitu u 69 obézních dětí (40 dívek, 29 chlapců; průměrný věk 13,1±0,38 let; průměrná tělesná hmotnost 74,2±2,79 kg; průměrný úbytek hmotnosti během terapie 6,8 kg) a u 32 kontrol se srovnatelným rozložením věku a pohlaví. Ke stanovení množství podkožního tuku byla provedena antropometrická měření s použitím Matiegkovy metody založené na měření tloušťky kožních řas.
Výsledky: Hladiny adiponektinu před redukcí tělesné hmotnosti byly 16,8±0,85 ng/ml a po redukci 17,0±0,82 ng/ml (N.S., p=0,6309). Hladiny u kontrolní skupiny byly 22,4±1,80 ng/ml a signifikantně se lišily od hladin u obézních jedinců před (p=0,0017) i po redukci hmotnosti (p=0,0021). Hladiny adiponektinu se signifikantně nelišily mezi dívkami (17,3±1,16 ng/ml) a chlapci (15,7±1,07 ng/ml, p=0,3385). Nalezli jsme negativní korelaci mezi hladinami adiponektinu a insulinu (r=–0,3905; p=0,0012), C-peptidu (r=–0,3859; p=0,0014), věkem (r=–0,4143; p=0,0012), tělesnou výškou (r=–0,3684; p=0,0044), tělesnou hmotností (r=–0,3888; p=0,0026), body mass indexem (r=–0,3664; p=0,0047) a množstvím podkožního tuku (r=–0,272; p=0,0388).
Závěr: Sérové hladiny adiponektinu negativně korelují s insulinem, C-peptidem, věkem, tělesnou výškou, tělesnou hmotností, body mass indexem a množstvím tělesného tuku, ale nejsou ovlivněny střednědobými změnami tělesné hmotnosti u dětí. Studie byla podpořena grantem IGA MZ NE/7443-3 a GAUK 59/2004C.
 
EXPRESE SIGNÁLNÍCH MOLEKUL LAT A PAG U LEUKEMIÍ
Burjanivová Tatiana, Kalina Tomáš¹, Mužíková Kateřina, Trka Jan, Zuna Jan. CLIP, Klinika dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a ¹Ústav imunologie UK 2. LF.
Školitel: MUDr. Jan Zuna, Ph.D
 
Akutní lymfoblastická leukemie (ALL) je nejčastějším nádorovým onemocněním u dětí. Navzdory pokrokům ve výzkumu leukemií existuje rozsáhlá skupina ALL, u kterých není znám genetický podklad. V souvislosti s etiopatogenesí ALL by mohly hrát důležitou roli nedávno objevené adptorové proteiny (LAT, PAG, NTAL a další). Představují totiž klíčové mediátory signalizačných kaskád lymfocytů. V roce 2003 bylo publikováno, že „leukemický“ fenotyp vznikající po infekci kravských lymfocytů parazitem Theileria parva je spojen se sníženou expresí a fosforylací PAG proteinu. Narušení LAT genu vede zase k poruchám signalizace T i B lymfocytů. Změněná exprese příp. fosforylace uvedených molekul tedy může významně ovlivňovat lymfocytární transformaci. V našem projektu se snažíme sledovat expresi genů PAG a LAT u pacientů s ALL. Na monitorování exprese m-RNA genů PAG a LAT jsme zavedli metodu reversně-transkriptasové PCR v reálném čase. Expresi genů PAG a LAT jsme vyšetřili u 14 pacientů s diagnosou T-ALL (4 x praeT-ALL, 5x zralá T-ALL, 5x intermediární T-ALL) a u 15 pacientů s diagnosou ALL z prekursorů B-buněk (9 x cALL, 1 x proB, 4 x praeB, 1 x zralá B). Jako kontrolu jsme použili populace T a B lymfocytů 6 zdravých jedinců, které jsme získali pomocí cell-sorteru. U genu LAT jsme pozorovali výrazné snížení exprese u T-ALL v porovnání s odpovídající kontrolou. Signifikantní byly i rozdíly v expresi genu PAG u pacientů s B-ALL v porovnání s B lymfocyty zdravých jedinců (zvýšení u ALL). Zajímavá data jsme získali i u pacientů s T-ALL. Tady jsme detekovali výrazně sníženou expresi genu PAG v porovnání s jeho expresí u periferních T lymfocytů zdravých jedinců. Předpokládáme, že tento gen, který v T-lymfocytech inhibuje aktivitu src kinas, by mohl u tohoto typu ALL fungovat jako tumor supresor. Víc nám však ukáže analýza dalších vzorků i subpopulací prekursorů B a T lymfocytů.
Podporováno grantem GAUK 50/2005.
 
METYLAČNÍ ANALÝZA SYNDROMŮ PRADER-WILLI A ANGELMAN
Čalounová G.¹, Bóday A.^1,2, Havlovicová M.¹, Zumrová A.³, Maříková T.¹, Apltová L.¹, Števove J.¹, Goetz P.¹ .¹ Ústav biologie a lékařské genetiky, UK 2. LF a FN Motol, Praha, ² Onkologické centrum J. G. Mendela, Nový Jičín, ³ Klinika dětské neurologie, UK 2. LF a FN Motol, Praha
Školitel: prof. MUDr. Petr Goetz, CSc.
 
Syndromy Prader-Willi a Angelman jsou klinicky zcela odlišné jednotky, které spojuje chromozomální oblast 15q11-q13. Incidence obou syndromů (vznikají v 98 % de novo) je udávána kolem 1/15000 nově narozených. Syndrom Prader-Willi je způsoben absencí paternálního genetického materiálu oblasti 15q11-q13. Absence maternálního genetického materiálu je příčinou Angelmanova syndromu. Geny pro oba syndromy leží v těsné blízkosti a jejich exprese je regulována tzv. genomovým imprintingem. Mechanismus poruchy u obou syndromů je heterogenní, ve většině případů se jedná o delece oblasti 15q11-q13, uniparentální disomie a v menší míře jsou příčinou obou syndromů imprintingové mutace či balancované translokace. U Angelmanova syndromu se dále vyskytují mutace v UBE3A genu.
K průkazu obou syndromů se užívají metody v závislosti na typu a četnosti etiologických příčin. FISH analýza odhalí rozsáhlé delece oblasti 15q11-q13. Analýza vysocepolymorfních lokusů je účinnější, odhalí nejen delece ale i uniparentální disomie, ale závisí na informativitě v rodině. Metoda metylační analýzy oblasti SNRPN/SNURF odhalí nejen delece a uniparentální disomie, ale i imprintingové mutace a navíc eliminuje závislost na informativitě v rodině. Kombinace výše uvedených metod umožní verifikaci a detailní specifikaci kauzálních příčin obou syndromů. V rámci tohoto sdělení poukazuji na využití těchto metod a jejich kombinaci na třech zajímavých případech. Práce je podporována grantem GAUK 61/2004.
 
NOVÁ KOMPOZITNÍ MATRICE NA BÁZE AUTOLOGNÍCH CHONDROCYTŮ REPARUJE OSTEOCHONDRÁLNÍ DEFEKT KRÁLIKA
Filová Eva ^1,2, Rampichová Michala ^1,2, Handl Milan ³, Jelínek František ⁴, Lytvynets Andryi ⁵, Varga Ferdinand ¹, Činátl Jaroslav ⁶, Šimunová Lenka ^1,5, Trč Tomáš ³, Amler Evžen ^1,2. ¹Ústav biofyziky, UK 2. LF, Praha; ²Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha; ³Ortopedická klinika, Fakultní nemocnice Motol, Praha; ⁴Veterinární histopatologická laboratoř, Praha 9; ⁵Fyziologický ústav AV ČR, Praha; ⁶Klinika dětské onkologie, Fakultní nemocnice Motol, Praha
e-mail: @email Školitel: RNDr. Evžen Amler, CSc.
 
Mezi nové trendy v terapii chondrálních lézí patří použití autologních chondrocytů ve vhodné prostorové matrici. Tyto matrice zvyšují reparační schopnost chondrocytů, zabezpečují výživu buněk, umožňují jejich rediferenciaci, produkci extracelulární matrix a dávají jim dostatečnou mechanickou pevnost. Pozornost mnoha pracovišť se soustřeďuje především na biodegradovatelné matrice obsahujíci jak kyselinu hyaluronovou a kolagen, tak i různé syntetické polymery.
V naší studii byla hodnocená kompozitní matrice složená z fibrinu, kolagenu a kyseliny hyaluronové. Izolované autologní chondrocyty byly nasazené do matrice a implantované do osteochondrálního defektu kondylu femuru králika. Po šesti týdnech byla kolena vyjmuta a vyhodnocena histologicky a imunohistochemicky . V novotvořené tkáni byly pozorovány znaky diferencované chrupavky: kulatý nebo oválný tvar buněk, jejich organizace do sloupců. Barvení Alcianovou modří ukázalo větší obsah kyselých a menší obsah neutrálních glykozaminoglykanů než v normální chrupavce. Imunohistochemické barvení na důkaz kolagenu typu II bylo pozitivní v retikulární tkáni kostní dřeně.
 
Výzkum byl podpořen Grantovou agenturou České republiky (grant č. 305/03/H148) a Výzkumním záměrem AVOZ 50110509.
 
ÚLOHA MINIMÁLNÍ RESIDUÁLNÍ NEMOCI V LÉČEBNÝCH PROTOKOLECH DĚTSKÉ ALL
Froňková Eva, Řezníčková Leona, Mužíková Kateřina, ¹Mejstříková Ester, Hrušák Ondřej, ²Schrappe Martin, Starý Jan, Trka Jan. CLIP, Klinika dětské hematologie a onkologie UK 2. LF, ¹Ústav imunologie UK 2. LF, ²Dept. of Pediatrics, University Hospital Schleswig-Holstein, Kiel, SRN
Školitel doc. MUDr Jan Trka, Ph.D.
 
Minimální residuální nemoc (MRN), určovaná kvantitativně pomocí RQ-PCR na přestavby imunoreceptorových genů (Ig/TCR), je nezávislým prognostickým ukazatelem odpovědi na léčbu u dětí s akutní lymfoblastickou leukemií (ALL). Pacienti v ČR jsou léčeni podle protokolu ALL IC-BFM 2002, který stratifikuje pacienty do rizikových skupin podle věku, počáteční leukocytosy a morfologických kritérií – procenta blastů v periferní krvi (PB) v den+8 a v kostní dřeni (BM) v den+15 a +33. Jedním z cílů tohoto protokolu je porovnání rizikové klasifikace s kritérii využívajícími MRN v paralelním německém protokolu ALL-BFM 2000. V ČR bylo od počátku používání protokolu (11/2002) do konce roku 2004 léčeno celkem 135 pacientů. Dosud jsme vyšetřili 80 pacientů, u 77 z nich (96,3 %) jsme nalezli alespoň jeden cíl pro sledování MRN s citlivostí 10(–4) podle pravidel ESG-MRD-ALL. U těchto pacientů jsme vyšetřili hladinu MRN v BM v týdnech +5 a +12; u pacientů s T-ALL i v PB. Celkem jsme vyšetřili 527 vzorků BM a 72 PB. U 9 pacientů (25 %) SR jsme nalezli v týdnu +5 a/nebo +12 detekovatelnou MRN v rozmezí 6.3x10(–5) – 1.5x10(–2). Tito pacienti by se v protokolu ALL-BFM 2000 nekvalifikovali do skupiny SR. Výsledky u pacientů s T-ALL potvrdily, že hladiny MRN v PB jsou srovnatelné s BM. Tyto předběžné výsledky dokládají rozdíl v praktické stratifikaci pacientů v protokolech ALL IC-BFM 2002 a ALL-BFM 2000. Ukazuje se, že rychlá morfologická odpověď na léčbu (BM M1 nebo M2 v den+15) spolu s dalšími známkami nízkého rizika nezbytně nekorespondují s rychlým poklesem MRN. Kompletní analysa MRN všech rizikových skupin je plánována v rámci mezinárodního konsorcia ALL IC-BFM 2002.
Podpora: grant 62/2004 GAUK ČR.
 
STUDIUM POLYMORFISMŮ V KANDIDÁTNÍCH GENECH V POPULACI ADHD DĚTÍ
Gazdíková M.¹, Bóday Á.¹, Paclt I.², Goetz P.^1
1Neurogenetické centrum, Ústav biologie a lékařské genetiky, UK 2. LF a FN Motol, Praha, ²Psychiatrická klinika, UK 1. LF a VFN, Praha
Školitel: prof. MUDr. Petr Goetz, CSc.
 
Hyperkinetický syndrom se vyskytuje asi u 6–10 % dětské populace v poměru chlapců a dívek 3 až 10:1 (dle diagnostických kritérií). K základním symptomům patří nadměrná aktivita, nepozornost a impulzivita, výjimkou nejsou ani další přidružené psychické poruchy.
ADHD je onemocnění multifaktoriální, na jeho etiologii má podíl mnoho faktorů, genetických i environmentálních, a geneticky heterogenní. V současné době je známo více než 30 genů různých polygenních systémů podílejících se na vzniku a vývoji onemocnění. Jednotlivé alely těchto genů mohou být v populaci relativně časté, protože nepředstavují klasické mutace, které vyřazují gen z funkce, ale polymorfismy, které jsou příčinou arteficiální aktivity produktu ať už jde o transkripci, translaci či o dysbalanci různých isoforem výsledného proteinu.
V naší laboratoři jsme se zaměřili především na geny kodující jednotlivé proteinové složky dopaminergního systému, protože některé struktury, zahrnuté do patogeneze ADHD, jsou bohaté na dopaminovou inervaci. Vyšetřujeme souvislost mezi poruchou pozornosti/hyperaktivním syndromem a polymorfismy v genech pro dopaminové receptory (DRD2, DRD3, DRD4 a DRD5), dopaminový transportét (DAT1), dopamin-b-hydroxylázu (DBH), enzym, zapojený do metabolizmu dopaminu, a serotoninový transportér (5-HTT). Sledujeme přítomnost rizikových alel v souboru 83 dětí s ADHD ve věku 3 až 12 let a 92 kontrol. Též hodnotíme vliv těchto rizikových alel a kombinaci vlivů alel vzájemně interagujících genů na vývoj a závažnost onemocnění a výskyt dalších komorbidit.
Předběžné výsledky svědčí o souvislosti mezi TaqA1 polymorfismem (DRD2) a ADHD. Homozygoti pro tuto rizikovou alelu se ve vyšetřovaném souboru vyskytovaly s výrazně vyšší frekvencí u postižených dětí než u kontrolní skupiny. U ostatních genů byly rizikové alely přítomny v nadpoloviční většině ve skupině dětí s ADHD.
 
JE K ÚSPĚŠNÉMU PŘENOSU SIGNÁLU PŘES DIMERNÍ RECEPTOR SPŘAŽENÝ S G-PROTEINY NUTNÉ AKTIVOVAT OBĚ JEHO PODJEDNOTKY? Hlaváčková Veronika, Jean-Philippe Pin (¹) a Jaroslav Blahoš Odd. molekulární farmakologie, Ústav experimentální medicíny AV ČR, Praha a (¹) Laboratoire de Mecanismes Moleculaire des Communications Cellulaires, C.N.R.S., Montpellier, France
 
Pro komunikaci s okolním prostředím používají buňky receptory, nacházející se na plazmatické membráně nebo uvnitř buňky. Velmi různorodou, obsáhlou a evolučně úspěšnou skupinu membránově vázaných receptorů tvoří receptory spřažené s G-proteiny (GCPRs). Tyto receptory jsou schopné přenést zprávu od velmi odlišných ligandů od fotonů, přes jednoduché organické sloučeniny k hlavním neuropřenašečům, glutamátu a γ-aminomáselné kyselině (GABA). Podle sekvenční podobnosti byly tyto receptory rozděleny do tří skupin a ačkoli tyto skupiny navzájem nevykazují sekvenční homologii, mají společné strukturní prvky, centrální transmembránovou doménu, kterou tvoří 7 α-helixů, extracelulárně uložený N-konec a intracelulárně uložený C-konec. V současné době byla uznána hypotéza, že GPCRs různých typů mohou vytvářet funkční hetero- či homodimery nebo vyšší oligomery. Dimerizace ovlivňuje farmakologické vlastnosti receptorů, přenos signálu přes G-proteiny do nitra buňky, buněčný transport a další procesy. Na rozdíl od heteromerního GABA_B receptoru, metabotropní glutamátové receptory (mGluRs) vytvářejí homodimery, ačkoli oba receptory patří do společné třetí rodiny GPCRs. Protože je známo, že při přenosu signálu přes GABA_B receptor se účastní jen jedna z jeho podjednotek, zatímco druhá je důležitá pro vazbu ligandu, zaměřili jsme se v naší studii na odhalení mechanismu aktivace mGluRs. Zajímalo nás, zda je k úspěšné aktivaci dimerního receptoru spřaženého s G-proteiny nutná aktivace obou jeho podjednotek?
 
EXPRESE NEURONÁLNÍ SYNTÁZY OXIDU DUSNATÉHO V MOZEČKU SHR POTKANŮ JE SNÍŽENÁ
Hojná S., Dobešová Z., Zicha J., Kuneš J.
Fyziologický ústav AV ČR
Školitel: RNDr. Jaroslav Kuneš DrSc.
 
Vysoký krevní tlak (TK) spontánně hypertenzních potkanů (SHR) je z velké části podmíněn vysokou aktivitou sympatického nervového systému, která je dána centrálními mechanismy. Je známo, že sympatický tonus je zvyšován centrálním renin-angiotenzinovým systémem (RAS) a naopak tlumen centrálním systémem oxidu dusnatého. Proto jsme se zaměřili na studium exprese neuronální syntázy oxidu dusnatého (nNOS) v mozečku potkanů s genetickou hypertenzí a srovnávali ji s normotenzními potkany Wistar Kyoto (WKY) a s potkany SHR, jejichž TK byl normalizován dlouhodobým podáváním ACE inhibitoru (captopril 100 mg/kg/den). Ke stanovení exprese proteinu nNOS jsme použili metodu western blot. Krevní tlak byl u SHR významně vyšší (181 ± 7 mm Hg) oproti kontrolám WKY (111± 3 mm Hg), zatímco léčba SHR captoprilem snížila jejich TK na kontrolní úroveň (112 ± 6 mm Hg). Z grafu je patrná výrazně snížená exprese nNOS a to jak u SHR, tak i u SHR léčených captoprilem ve srovnání s WKY. Námi získané výsledky podporují představu, že centrálně vytvořený oxid dusnatý tlumí vliv centrálního RAS na sympatický tonus méně u SHR než u WKY. Chronická léčba captoprilem sice neovlivnila expresi nNOS u SHR, ale svým tlumivým vlivem na tvorbu centrálního angiotenzinu ll snižila krevní tlak i sympatický tonus.
 

 
METODIKA IDENTIFIKÁCIE DENDRITICKÝCH BUNIEK A ICH SUBPOPULÁCIÍ V PERIFÉRNEJ KRVI POMOCOU VYUŽITIA MNOHOFAREBNEJ PRIETOKOVEJ CYTOMETRIE (FACS ARIA).
Horváth Rudolf, Kalina Tomáš, Semerák Pavel, Špíšek, Radek, Bartůňková Jiřina, Ústav Imunologie UK 2. LF a FN Motol.
Školiteľ MUDr. Radek Špíšek, Ph.D.
 
Dendritické bunky (DC) predstavujú jednu z kľúčových komponent imunitného systému. Zohrávajú úlohu v mnohých imunitných reakciách organizmu, čo vedie k neustále zvyšujúcemu sa počtu štúdií so zameraním sa na ich úlohu v etiopatogenéze rozličných ochorení. Výskum DC sa doposiaľ sústredil na DC pripravené z monocytov periférnej krvi technikami in vitro. Súčasné moderné technológie dovoľujú obrátiť pozornosť na jednotlivé subpopulácie DC, ktoré sú prítomné priamo v periférnej krvi. Cieľom našej štúdie bolo vypracovanie vhodnej metodiky na identifikáciu DC a ich subpopulácií v periférnej krvi, pomocou využitia mnohofarebnej prietokovej cytometrie (FACS Aria). FACS Aria umožňuje sledovanie až 9 povrchových markerov naraz na jednej bunke, ako aj sortovanie definovaných subpopulací. DC boli identifikované na základe známej expresie povrchových antigénov. Definovali sme ich ako skupinu buniek lineage-negatívnych, teda neexprimujúcich antigény CD3^–,CD14^–,CD19^–,CD56^– a zároveň buniek HLA DR⁺. Následne pomocou značenia protilátkami CD11c a CD123 sme ich sekvenčním gateovaním rozdelili na dve základné podskupiny. Bunky s monocytoidným výzorom a expresiou CD11c⁺ a CD123^lo tvorili podskupinu myeloidných DC (MDC). Druhú hlavnú podskupinu tvorili plazmacytoidné DC (PDC) s expresiou CD11c^– CD123^hi. Ako poslednú sme optimalizovali metodiku posudzovania aktivačného štatútu DC na základe pozitivity expresie povrchových kostimulačných molekúl CD80, CD83 a CD86. Pomocou nej sme boli schopný posúdiť maturačné štádium DC, ich podskupín a rozdeliť ich na zrelé a nezrelé formy. Prietoková cytometria s využitím prístroja FACS Aria prináša elegantnú a komplexnú možnosť zhodnotenia DC, ich podskupín a maturačného štádia v periférnej krvi, čím poskytuje paletu širokého využitia v dizajnovaní nových štúdií so zameraním sa na rolu DC pri etiológii rôznych ochorení vrátane hematologických malignít, autoimunít a imunodeficitov.
 
Tento projekt je podporovaný VZ MŠM č.0021620812 a grantom GAUK č.52/2005/C/2.LF
 
ABERACE CHROMOZOMU Xp22 A JEJICH MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA
Hrabáková, J.¹, Pánek, M. ¹, Baxová, A. ², Flachsová, E. ³, Kočárek, E. ^1
1 Ústav biologie a lékařské genetiky UK 2. LF, ² Ústav biologie a lékařské genetiky VFN a UK 1. LF, ³ Klinika dětského a dorostového lékařství VFN Praha
Školitel: RNDr. Eduard Kočárek, Ph.D.
E-mail: @email
 
Tento příspěvek je zaměřen na analýzu genu pro steroidní sulfatázu (STS), který je lokalizován v distální části krátkého raménka chromozomu X (Xp22.3). Delece tohoto genu vyvolává u postiženého jedince onemocnění nazývané X-vázaná ichtyóza (XLI). Ve většině případů se jedná o deleci celého genu pro STS. Jen asi v 15 % se jedná o bodovou mutaci. V některých případech však může dojít k rozsáhlejší deleci oblasti, zasahující i do sousedního lokusu (Kall), jehož haploinsuficience se klinicky projeví jako Kallmanův syndrom. Steroid sulfatáza v epidermis katalyzuje hydrolýzu cholesterol sulfátu, která je zřejmě nutná k normálnímu vývinu a deskvamaci epidermis. Je dále nezbytná pro metabolismus cholesterolu a tvorbu keratinu v kůži.
Z těchto důvodů jsme se v naší laboratoři zaměřili na vyšetřování těchto lokusů metodou FISH, pomocí lokus specifické sondy od firmy Vysis. FISH diagnostika delece genu pro STS slouží k diferenciální diagnostice proti ostatním typům ichtyóz. Výsledků vyšetření se dá využít také v prenatální diagnostice. V neposlední řadě je analýza STS regionu využívána při vyšetření komplikovaných případů ichtyóz kombinovaných s Kallmanovým syndromem.
Analýza STS regionu je v naší laboratoři prováděna v posledních dvou letech. Proto si v tomto příspěvku dovolujeme prezentovat kazuistiku, v které byl prokázán přenos deletovaného X chromozomu již po několik generací. V rodině jsme identifikovali tři přenašečky a dva postižené muže.
 
PLAZMATICKÉ A RENÁLNÍ KONCENTRACE ANGIOTENZINU II V PRŮBĚHU ROZVOJE HYPERTENZE U REN-2 TRANSGENNÍCH POTKANŮ
Husková Zuzana, Vaňourková Zdeňka a Weber Albert. Centrum experimentální medicíny, IKEM.
Školitel: doc. MUDr. Luděk Červenka, CSc.
 
Cílem této studie bylo stanovit plazmatické a renální koncentrace ANG II u Ren-2 transgenních potkanů a zjištěná data porovnat s hodnotami naměřenými u kontrolních zvířat. Střední arteriální tlak, index váhy srdce ku tělesné hmotnosti a hladiny ANG II v plazmě i v ledvinách byly měřeny u 32 (n=10), 38 (n=10), 52 (n=10) a 90ti (n=10) denních transgenních potkanů kmene TGR (mRen2)27 a stejně starých transgen-negativních samců kmene HanSD. Všechna zvířata byla krmena normoslanou dietou (NS: 0,45% NaCl) po dobu čtyř dnů. Výsledky: Transgenní potkani začínají vyvíjet hypertenzi přibližně v šestém týdnu života. U 32, 52 a 90ti denních TGR byla zjištěna znatelná hypertrofie srdce. Plazmatické koncentrace ANG II byly vyšší u 32 denních HanSD v porovnání s TGR stejného stáří, renální koncentrace ANG II byly naopak statisticky vyšší u 38 a 52 denních TGR. U TGR, všech věkových skupin, byly naměřeny výrazně vyšší renální koncentrace ANG II v porovnání s plazmatickými koncentracemi ANG II. U HanSD takto výrazný rozdíl nebyl pozorován. Závěr: Jelikož je kmen TGR (mRen2)27 nízkoreninový, naměřené vyšší hodnoty ANG II v ledvinách, v porovnání s plazmatickými koncentracemi, poukazují na to, že hladina ANG II v ledvinách je na reninu nezávislá.
 
ODOLNOST SRDCE K NEDOSTATKU KYSLÍKU U NEONATÁLNÍCH SPONTÁNNĚ HYPERTENZNÍCH POTKANŮ (SHR)
Chvojková Z., Ošťádalová I., Kuneš J., Zicha J., Ošťádal B. (školitel), Centrum pro kardiovaskulární výzkum a Fyziologický ústav, Akademie věd České republiky, Praha
 
Úvod: odolnost srdce k nedostatku kyslíku u zdravých potkanů kmene Wistar se v průběhu časného postnatálního vývoje významně snižuje. Toleranci srdečního svalu novorozenců není možno zvýšit ischemickým preconditioningem; jeho protektivní efekt se projeví až na konci prvního postnatálního týdne [1]. Cílem naší práce bylo analyzovat časný postnatální vývoj tolerance myokardu k ischemii u spontánně hypertenzních potkanů a zjistit možný protektivní efekt IP.
Metoda: k pokusu byla použita 1denní a 10denní mláďata SHR a jejich kontrol (WKY). Srdce byla izolována a perfundována dle Langendorffa Krebs-Henseleitovým roztokem za konstantního tlaku, teploty a frekvence stimulace. Perfúzní tlak odpovídal střednímu arteriálnímu tlaku daného vývojového stadia [2]. Odolnost srdce k nedostatku kyslíku byla vyjádřena jako míra obnovení isometrické kontrakce po globální ischemii (40 min). IP (10. den) byl vyvolán třemi 3minutovými ischemickými periodami, přerušenými 5 min reperfúzí.
Výsledky: v obou věkových skupinách byla u SHR ve srovnání s WKY významně zvýšena relativní hmotnost srdce. Síla kontrakce, vztažená na hmotnost srdce, byla naproti tomu u SHR signifikantně snížena. Odolnost srdce k nedostatku kyslíku byla u 1denních SHR významně vyšší; 10. den nebyl v odolnosti k ischemii mezi SHR a WKY žádný rozdíl. Na rozdíl od kmene Wistar byl IP u 10denních mláďat obou sledovaných kmenů bez efektu.
Závěry: i) tolerance srdce k ischemii u obou kmenů po narození klesá; ii) odolnost srdce k ischemii je u jednodenních mláďat SHR signifikantně vyšší než u WKY; iii) u 10denních mláďat neměl IP žádný protektivní účinek.
[1] Ostadalova et al., Ped Res 2002;52: 561–567
[2] Clubb et al., Lab Invest 1987;56:189–197
 
MYELOIDNÍ ZNAKY U LYMFOBLASTICKÉ LEUKÉMIE
Kalina T.^1,2,3, Vášková M.^1,3, Mejstříková E.^1,3, Kanderová V.^1,3, Froňková E.^2,3, Trka J.^2,3, Starý J.² a Hrušák O.^1,3
Ústav Imunologie¹ a Klinika dětské hematologie a onkologie², UK 2. LF, CLIP – Childhood Leukemia Investigation Prague³
Školitel: Ondřej Hrušák
 
Aberantní exprese myeloidních antigenů na buňkách akutní lymfoblastické leukémie (ALL) je velmi dobře dokumentovaným fenoménem jehož význam je stále nejasný. V rámci dětských ALL (n=365) je nejčastějším aberantním znakem CD66c (ve 43 % případů), dále CD33 (23 %), CD15 (20 %), CD13 (16 %) a CD65 (3,8 %). Analýza vzájemného vztahu myeloidních antigenů pomocí Fisherova testu ukazuje, že současně jsou exprimovány pouze znaky CD33 a CD13 (p<0.0001) a CD15 a CD65 (p=0.0002). Naopak, molekula CD66c obvykle nevyskytuje zároveň s CD13, CD33 i CD65 (p<0.05). Analýzou stability exprese od diagnózy k relapsu jsme zjistili, že exprese CD66c je stabilní u všech pacientů (n=39), což neplatí o molekulách CD33, CD13 a CD15. Naše data odporují obvyklému schématu hodnocení ALL s myeloidními antigeny (MyAg+ALL) jako podskupiny ALL se společnými vlastnostmi. Tedy i prognostický význam je různý pro jednotlivé myeloidní antigeny na ALL a nelze jej hodnotit v kompozitním kritériu. CD66c velmi významně koreluje s přítomností genetických změn ALL buněk (CD66c je pozitivní u BCR/ABL a hyperdiploidní a negativní u TEL/AML1). Prognostický význam v naší kohortě však jako celek ani v jednotlivých rizikových podskupinách nemá. Jako aberantní znak s dobrou stabilitou a relativně vysokým zastoupením je CD66c používána k imunofenotypické detekci minimální reziduální nemoci průtokovou cytometrií.
Podpořeno grantem GAUK 65/2004 a VZ MŠMT MSM0021620813
 
KVANTITATIVNÍ DETEKCE EXPRESE GENU WT1 U DĚTSKÝCH HEMATOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ – JE GEN WT1 MARKEREM MALIGNÍCH BUNĚK?
Kalinová, M. (^1,3), Mužíková, K. (^1,2), Mejstříková, E. (⁴), Šrámková, L.(^1,2), Starý, J. (²), Trka, J. (^1,2)
(¹) CLIP – Childhood Leukaemia Investigation Prague, (²) Klinika dětské hematologie a onkologie, (³) Ústav patologie a molekulární medicíny, (⁴) Ústav imunologie UK 2. LF Praha, školitel: doc. MUDr. Jan TRKA, Ph.D, @email
Gen WT1 je transkripční faktor jehož funkce během hematopoézy není zcela známa. Zabývali jsme se kvantitativní detekcí exprese genu WT1 (WT1-RT-RQ-PCR) u maligních a nemaligních hematologických onemocnění.
Vyšetřili jsme 14 pacientů s myelodysplastickým syndromem (MDS), 25 pacientů s aplastickou anémií (AA). Pacienti s AA exprimují gen WT1 na velice nízké úrovni v porovnání s pacienty s MDS a hladina exprese genu WT1 se jeví jako marker maligního onemocnění, je však nutné další rozšíření souboru.
S pracovištěm v Irsku jsme vyšetřovali expresi genu WT1 u dětských pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL). Pacienti s ALL nesoucí fúzní gen MLL/AF4 měli signifikantně vyšší hladinu exprese genu WT1 v porovnání s ostatními pacienty s ALL. Prospektivně jsme pokračovali ve vyšetřování hladin minimální reziduální nemoci (MRN) pomocí (WT1-RT-RQ-PCR) u 20 dětských pacientů s akutmí myeloidní leukémií (AML) s vysokou expresí genu WT1 při diagnóze (dg) . Soubor jsme rozšířili o nově diagnostikované AML (14 pacientů), z nichž u pacientů s vysokou expresí (9 pacientů) proběhlo prospektivní sledování MRN. Hladiny MRN pomocí (WT1-RT-RQ-PCR) jsme porovnávali s výsledky tří/čtyřbarevné průtokové cytometrie – srovnání vykazuje velmi dobrou korelaci.
U dětských pacientů (ALL – 11 pacientů, AML – 13 pacientů, MDS – 5 pacientů) podstupujících transplantaci kostní dřeně (TKD) jsme sledovali možnou predikci postTKD relapsu na základě (WT1-RT-RQ-PCR) a u pacientů s ALL jsme výsledky porovnávali s vyšetřením přestaveb imunoreceptorových genů.
Podporováno granty #7439 IGA MZ, #0021620813 MŠMT ČR a #00064203 – 6073 VZ MZ ČR.
 
FUNKČNÍ A FENOTYPICKÉ ZMĚNY DENDRITICKÝCH BUNĚK PO STIMULACI OVALBUMINEM
Kayserová Jana, Tobiásová Zuzana, Ústav imunologie UK 2. LF a FNM
Školitelka: doc.MUDr. Anna Šedivá, Csc.
 
Úvod: Alergická onemocnění jsou podmíněna převahou Th2 imunitní odpovědi.Ovalbumin (OVA) tvoří část vaječného bílku, který je jedním z nejčastějších potravinových alergenů. Dendritické buňky (DC) jsou antigen prezentující buňky schopné zahájit imunitní odpověď a aktivovat naivní T lymfocyty. Toho jsou schopny až zralé DC, které předtím prošly procesem maturace.V tomto pokusu jsme zkoumali fenotypické a funkční změny DC po stimulaci OVA u zdravých jedinců a u pacienta s positivními specifickými IgE proti OVA.
Materiály a metody: Vyšetřili jsme 3 zdravé dárce a jednoho alegického pacienta. Nezralé DC jsme získali z monocytů periferní krve.Monocyty jsme kultivovali v přítomnosti GM-CSF a IL-4 v kompletním kultivačním médiu. Šestý den jsme k nezralým DC přidali ovalbumin v koncentraci 100mg/ml a jako pozitivní maturační kontrolu lipopolysacharid (LPS) v koncentraci 1mg/ml. Následně jsme sledovali fenotypické změny pomocí FACS analýzy a funkční změny (schopnost fagocytozy).
Výsledky: Dle fenotypické analýzy a schopnosti fagocytozy jsme zjistili maturační vliv ovalbuminu na DC. Nenalezli jsme žádné funkční ani fenotypické rozdíly mezi DC zdravých dárců a alergického pacienta.
Závěr: Prezentované data jsou výsledky prvotních pokusů jak potravinový alergen ovlivňuje funkci DC.
 
VÝSLEDKY LĚČBY FUNKČNÍCH PORUCH TLUSTÉHO STŘEVA A KONEČNÍKU NA CHIRURGICKÉ KLINICE UK 2. LF A FN MOTOL
Kouda Martin. Chirurgická klinika UK 2. LFa FN Motol. Školitel prof. MUDr. Jiří Hoch, CSc.
 
Funkční poruchy vyprazdňování jsou závažným, častým a nesnadno ovlivnitelným problémem, výrazně snižujícím kvalitu života. Skupinou našeho zájmu jsou nemocní trpící obstipací, zejména ODS ( obstructive defecation syndrom ) a inkontinencí. Předmětem sdělení je prezentace a zhodnocení algoritmů vyšetření vedoucích k stanovení příčiny onemocnění. V druhé části prezentace pak u případů splňujících indikační kritéria možnosti chirurgického ovlivnění se zhodnocením výsledků.
Soubor zahrnuje 154 nemocných vyšetřených pro obstipaci a 35 pro inkontinenci v období let 2000–2004. Z těchto pro obstipaci bylo indikováno a operováno 25, pro inkontinenci 3.
 
VLIV AKUTNÍ HYPERINZULINÉMIE A BLOKÁDY AT-1 RECEPTORU NA PLAZMATICKÉ HLADINY RESISTINU A JEHO EXPRESI V PODKOŽNÍ TUKOVÉ TKÁNI U ZDRAVÝCH OSOB
Krušinová E.¹, Klementová M.¹, Kazdová L.¹, Pravenec M.², Skibová J.¹, Pelikánová T.^1
1Centrum diabetologie, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha
²Fyziologický ústav, Akademie věd České republiky, Praha
 
Úvod: V patofyziologii inzulínové rezistence je v současné době zvažována mimo jiné úloha resistinu. Cílem naší studie bylo: a) detekovat plasmatické hladiny resistinu a jeho expresi v podkožní tukové tkáni břicha a b) testovat jejich odpověď na akutně navozenou hyperinzulinémii a akutní blokádu AT-1 receptorů u zdravých osob.
Metodika: U 8 štíhlých zdravých mužů byly měřeny koncentrace resistinu v plazmě: 1) v čase 0 min, 30 min a 240 min hyperinzulínového (1 mU.kg–¹.min–¹) euglykemického (5 mmol.l–¹) clampu (HIC), a 2) během HIC po akutní blokádě AT-1 receptoru (losartan 200mg) (AT-HIC) ve stejném časovém schematu. V obou clampech byla v čase 0 min, 30 min a 240 min provedena jehlová biopsie podkožního tuku na břiše, vzorky byly dále zpracovány pro stanovení exprese resistinu metodou RT-PCR (exprese mRNA resistinu vztažená k expresi mRNA cyclophilinu).
Výsledky: V inzulínové senzitivitě během HIC a AT-HIC nebyly zachyceny žádné signifikantní rozdíly, vyjádřeno pomocí spotřeby glukózy (9,16±1,0 vs. 9,62±1,77 mg.kg–¹.min–¹) a metabolické clearence glukózy (11,04±1,74 vs. 11,35±2,44 ml.kg–¹.min–¹).
Koncentrace resistinu v plazmě signifikantně vzrostla ve 30 min HIC (0 min; 30 min; 240 min: 5,51±5,28 vs. 6,63±6,45 vs. 6,96±7,50 ng.ml–¹; p<0,05 pro 0 min vs. 30 min), obdobné změny byly pozorovány během AT-HIC (0 min; 30 min; 240 min: 5,61±5,45 vs. 6,24±5,94 vs. 7,47±7,35 ng.ml–¹; p<0,05 pro 0 min vs. 30; 240 min). Pro expresi resistinu v podkožní tukové tkáni břicha byl ve 240 min HIC zaznamenán signifikantní vzestup (0 min; 30 min; 240 min: 3,69±1,85 vs. 6,02±3,94 vs. 21,43±26,71; p<0,05 pro 0 min vs. 240 min); po AT-1 inhibici byla zachycena reakce opačná – signifikantní pokles (0 min; 30 min; 240 min: 5,61±4,98 vs. 9,27±11,79 vs. 3,16±1,05; p<0,05 pro 30 min vs. 240 min).
Závěry: U zdravých jedinců je hyperinzulinémie spojena se vzestupem plazmatické hladiny resistinu nezávisle na inhibici AT-1 receptoru. Inzulínem stimulovaná exprese resistinu v podkožní tukové tkáni břicha je akutní blokádou AT-1 receptorů modifikována. Uvedené změny plazmatických hladin nelze zcela vysvětlit změnami exprese v podkožní tukové tkáni, což nasvědčuje tomu, že se na změnách sekrece resistinu významně podílí tuková tkáň jiné anatomické lokalizace.
(podpořeno grantem NR/7880-3 IGA MZ ČR)
 
KVALITA VEŘEJNÝCH INFORMAČNÍCH ZDROJŮ OBSAHUJÍCÍCH ALTERNATIVNÍ METODY LÉČBY RAKOVINY: POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ SUBJEKTIVNÍ A OBJEKTIVNÍ METODY HODNOCENÍ
Kubů Pavel, Hladíková Marie, Adla Theodor, Kasal Pavel, Potůčková Radka. Ústav lékařské informatiky UK 2. LF.
Školitel doc. MUDr. Pavel Kasal, CSc.
 
Kvalita veřejných zdravotnických informačních zdrojů je často diskutována v souvislosti s otázkou do jaké míry může být nekvalitní informace nebezpečná lidskému zdraví. V případě alternativních metod léčby rakoviny prezentovaných na internetu je doloženo, že taková informace může vést i ke smrti. Vzhledem ke trendu posledních let, který je charakterizován jednak rostoucím počtem webů nabízejících alternativní návody léčby či prevence rakoviny, jednak rostoucím počtem pacientů, kteří se těmito návody v průběhu celého nebo části svého onemocnění řídí, je zřejmé, že provádět objektivní hodnocení kvality u všech těchto webů a zprostředkovat jejich výsledky všem potenciálním zájemcům z řad pacientů je velmi obtížně realizovatelný úkol. Jednou z možností řešení je poskytnout veřejnosti nástroj s jehož pomocí si bude moci na základě hodnocení většinou objektivně měřitelných kritérií učinit představu o kvalitě daného informačního zdroje. Sandvikovo skóre představuje pro tento účel vhodnou třístupňovou škálu založenou na mezinárodně uznávaných kritériích kvality Health on the Net Code. Objektivně hodnotí kvalitu informačního zdroje v kritériích vlastnictví, autorství, zdroj, aktualizace a interaktivita. Na subjektivním názoru hodnotitele záleží výsledek měření vyváženosti obsahu a kvality navigace. V minulosti sice bylo toto skóre opakovaně použito při hodnocení kvality informačních zdrojů, hodnotitelem však vždy byl odborník na danou oblast zdravotní problematiky. Cílem studie Ústavu lékařské informatiky je porovnávání míry shody výsledků měření kvality populárních veřejných informačních zdrojů obsahujících alternativní metody léčby rakoviny za použití Sandvikova skóre onkology, lékaři z jiných oborů a několika skupinami laické veřejnosti s rozdílnou frekvencí používání internetu. Dále byla sledována míra shody hodnocení jednotlivých webů za použití Sandvikova skóre a automatického systému měření kvality zdravotnických informačních zdrojů Rankmed, který kvalitu sleduje na základě objektivně měřitelných kritérií pocházejících rovněž z Health on the Net Code.
 
IMUNOHISTOCHEMICKÉ PROGNOSTICKÉ FAKTORY INTRAKRANIÁLNÍCH EPENDYMOMŮ – SYSTEMATICKÝ PŘEHLED LITERATURY S META-ANALÝZOU
Kuncová Klára ¹, Zámečník Josef ¹, Janda Aleš ², Kodet Roman ¹.
¹ Ústav patologie a molekulární medicíny, ² Ústav imunologie a Ústav lékařské informatiky, UK 2. LF a FN Motol.
Školitel: MUDr. Josef Zámečník, Ph.D.
 
Možnost rozlišení mezi intrakraniálním ependymomem grade II a anaplastickým ependymomem grade III je podle čistě histologických kritérií stanovených současnou WHO klasifikací velmi problematické. Recentní studie ukazují, že zásadní roli v diferenciální diagnostice by mohly sehrát imunohistochemické prognostické markery (IPM). Proto jsme se rozhodli provést systematický přehled literatury zabývající se IPM u ependymálních nádorů a výsledky ověřit pomocí meta-analýzy publikovaných dat. Z celkového množství 952 publikací zabývajících se obecně prognostickými faktory u ependymomů (identifikovaných na základě 4 skupin klíčových slov pomocí on-line databází Medline a Embase) jsme získali 60 relevantních primárních studií, které se zabývaly IPM u těchto nádorů. Celkové množství studovaných antigenů bylo 32. Překvapující byla heterogenita publikovaných dat, jejich častá neúplnost a s tím spojená obtížná reprodukovatelnost výsledků. To výrazně omezilo možnost provedení meta-analýzy. Potřebná data k jejímu provedení se podařilo získat pouze ze 7 (11,6 %) prací, které vztahovaly výsledky k reprodukovatelnému celkovému přežití (overall survival), resp. k přežití bez progrese choroby (progression free survival) a nikoli pouze k subjektivně stanovenému stupni malignity dle histologie bez dalšího sledování vývoje onemocnění. Z těchto prací pak bylo možné provést meta-analýzu výsledků pouze pro detekci proteinů p53 a Ki-67. V obou případech jsme meta-analýzou potenciální prognostický význam potvrdili. Kromě prognostického významu IPM v diagnostice ependymomů chceme naší studií ukázat obecnou nezbytnost precizního publikování výsledných dat v primárních studiích pro možnost jejich následného využití.
Podpora projektu: VZ FNM 00064203.
 
PORUCHY PROSTOROVÉ KOGNICE U ALZHEIMEROVY CHOROBY, VASKULÁRNÍ DEMENCE A U MÍRNÉ KOGNITIVNÍ PORUCHY
Laczó Jan, Vlček Kamil¹, Hort Jakub, Bureš Jan¹. Neurologická klinika UK 2. LF a ¹Oddělení neurofyziologie paměti AVČR FgÚ.
Školitel doc. MUDr. Martin Bojar CSc.
 
Použili jsme dvě metody ke srovnání poruch prostorové kognice u Alzheimerovy choroby (AD), Vaskulární demence (VD) a u Mírné kognitivní poruchy (MCI). Oba testy se skládaly z reálné verze, prováděné v uzavřené aréně s průměrem 2,9 m, a z počítačové verze s modelem arény na obrazovce. V testu Skrytý cíl (HGT) bylo úkolem najít cíl skrytý v aréně ve všech 4 subtestech V závislosti na subtestu se k navigaci používala poloha startu a/nebo orientačních značek na stěně. V Testu prostorové paměti (SMT) bylo úkolem zapamatovat a poté si vybavit polohu 2, 4 a 6 bodů, ve správném pořadí. Šedesát vyšetřovaných bylo rozděleno do 4 skupin: AD, VD, MCI a kontroly. Diagnózy byly stanoveny podle kritérií NINCDS–ADRDA, NINCDS–AIREN a DSM-IV a podpořeny MRI volumetrií, stanovením biomarkerů v likvoru a standartním neuropsychologickým vyšetřením. Nejvýraznější rozdíly byly nalezeny v HGT, kde skupina AD byla poškozena ve všech 4 subtestech. Naproti tomu skupina VD byla poškozena jen v subtestu allotetické orientace. Skupina MCI byla poškozena jen v posledním subtestu – alloteze po třiceti minutovém oddálení. V SMT byly skupiny AD a VD poškozeny v zapamatování si polohy i pořadí prezentovaných bodů. Skupina MCI měla stejné výsledky jako kontroly. Naše závěry poukazují na rozsáhlejší poškození prostorové orientace u AD než u VD a na poruchu prostorové paměti u AD i u VD; a také potvrzují poruchu prostorové orientace u MCI. Podporováno grantem GAČR 309/05/0693.
 
ANTIKONVULZIVNÍ ÚČINNOST KOMPETITIVNÍHO ANTAGONISTY non-NMDA RECEPTORŮ U POTKANŮ
Lojková D., Mareš P. Fyziologický ústav AV ČR v Praze. Školitel: prof. MUDr. Pavel Mareš, DrSc.
 
NBQX (2,3-amino-3-(3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-yl)propionová kyselina) je kom-petitivním antagonistou non-NMDA typu receptorů pro excitační aminokyseliny. Ve srovnání s antagonisty NMDA receptorů má mírnější vedlejší účinky a vyšší antikonvulzivní efekt i neuroprotektivní účinnost u některých modelů neurologických onemocnění. Proto je předmětem studia i u neurodegenerativních poruch.
Cílem práce bylo stanovit účinky NBQX na modelu korových epileptických následných výbojů (NV) a na korových evokovaných potenciálech (EP) u laboratorních potkanů.
Použili jsme dospělé samce kmene Wistar, kteří měli implantované korové elektrody. NBQX v dávce 30 a 60 mg/kg jsme rozpustili v dimethylsulfoxidu (DMSO), kontrolní zvířata dostala pouze DMSO (vždy 0,5ml/1kg i.p.). Jednotlivé skupiny zvířat tvořilo 8 potkanů.
NV byly vyvolávány od 10 min po aplikaci NBQX opakovanou elektrickou stimulací sensorimotorické kůry se zvyšující se intenzitou (0,2–15 mA). EEG záznam byl pořízen před stimulací, během ní a asi 2 min po jejím ukončení. Sledovanými parametry byla délka NV a prahové intenzity elektrického proudu.
EP bylo možno sledovat u zvířat opakovaně. Prvním měřením byla kontrolní stimulace před aplikací NBQX nebo DMSO, opakovaně jsme měřili s odstupem 15 min a 180 min po aplikaci. Intenzita v jednotlivých sériích měření se pohybovala v rozmezí od 0,2–4,0 mA. Stanovovali jsme prahy pro vyvolání odpovědí a porovnávali je u jednotlivých skupin.
NBQX, antagonista non-NMDA receptorů, prokázal velmi slabou účinnost jak u následných výbojů tak i u evokovaných potenciálů. Tento nález u dospělých zvířat se liší od účinků u mláďat potkana, kde NBQX vykazuje zřetelný antikonvulsivní efekt. Ten však s věkem klesá, proto můžeme předpokládat postupné zmenšování úlohy nonNMDA receptorů v genezi korových epileptických záchvatů.
 
ÚČINEK XANOMELINU NA PRESYNAPTICKOU REGULACI UVOLŇOVÁNI ACETYLCHOLINU V CENTRÁLNÍCH CHOLINERGNÍCH NEURONECH
Machová Eva, El-Fakahany Esam E.¹, Jakubík Jan a Doležal Vladimír, Fyziologický ústav AVČR, 14220 Praha, ¹University of Minnesota Medical School, Minneapolis, Minnesota. Školitel MUDr Doležal Vladimír DrSc
 
Xanomelin je agonista muskarinových receptorů, který se váže se stejnou afinitou na všechny podtypy muskarinových receptorů, ale ve funkčních pokusech vykazuje selektivitu pro podtypy M₁ a M₄. Vazebné pokusy ukázaly, že se xanomelin kromě kompetitivní vazby váže i téměř ireverzibilně (neodmyvatelně). Neodmyvatelně navázaný xanomelin ovlivňuje vazbu orthosterických ligandů jak alostericky tak kompetitivně. Provedli jsme funkční pokusy s cílem zjistit, zda tato neodmyvatelná vazba xanomelinu ovlivňuje presynaptickou autoregulaci uvolňování acetylcholinu (ACh) v mozkové kůře laboratorního potkana. Tuto autoregulaci zajišťují muskarinové M₂ receptory. ACh v mozkových řezech jsme označili pomocí radioaktivního cholinu a poté jsme tkáň preinkubovali 15 minut v přítomnosti 100 μM xanomelinu. Takto připravenou tkáň jsme promývali inkubačním roztokem bez xanomelinu a po hodině odmývání jsme měřili elektrickou stimulací vyvolané uvolňování značeného ACh. Preinkubace s xanomelinem silně snížila stimulované uvolňování ACh a to až na úroveň srovnatelnou s účinkem plného muskarinového agonisty karbacholu. Účinky karbacholu a xanomelinu nebyly aditivní. Antagonista muskarinových receptorů N-metylskopolamin (NMS) přítomný během preinkubace neblokoval inhibiční účinek xanomelinu. Přítomnost NMS během elektrické stimulace však částečně snížila inhibiční účinek preinkubace s xanomelinem. Výsledky těchto pokusů jsou v souladu s představou, že neodmyvatelně navázaný xanomelin může zasahovat do ortosterického vazebného místa a tím trvale stimulovat M2 receptor. Podporováno projektem AV0Z50110509 a granty GAAV5011206 a GACR305/05/0452.
 
PŘEDČASNÉ STÁRNUTÍ THYMU U NEURODEFEKTNÍCH LURCHER MYŠÍ
Manďáková P.¹, Šinkora J.², Šíma P. (školitel) ^3
1Ústav patologie a molekulární medicíny, UK 2. LF a FN Motol; ²DakoCytomation; ³Sektor imunologie a gnotobiologie, MBÚ AV ČR
 
Nervový, endokrinní a imunitní systém jsou vzájemně funkčně a v mnoha případech i strukturálně propojeny a vytvářejí tak komplexní homeostatický metasystém. Kooperace mezi nimi má za fyziologických i patologických podmínek povahu zpětnovazebných vztahů, které jsou zprostředkovány buď přímo buněčnými kontakty, přes nervová zakončení anebo humorálními faktory (cytokiny, peptidovými hormony a neurotransmitery). Dysfunkce některé ze složek neuro-endokrino-imunitního systému je provázena změnami, které se odrážejí v ostatních složkách metasystému.
Vrozená semidominantní mutace typu Lurcher způsobuje u myší progredující geneticky determinovaný defekt olivopontocerebelární oblasti. Paralelně s progresí neurodefektu je již u jednoměsíčních myší zjišťována makroskopická redukce velikosti thymu, která je výraznější ve věku tří měsíců. Na mikroskopické úrovni u tříměsíčních Lurcher myší pozorujeme zhoršené odlišení rozhraní kůry a dřeně a zvyšující se počet Hassallových tělísek. Dalšími znaky nasvědčujícími předčasnému stárnutí thymu je relativně zvýšený výskyt apoptotických a nekrotických buněk, stejně jako relativní úbytek méně zralých stádií thymocytů. Jejich pokles je kompenzován relativním vzestupem stádií maturovanějších.
Ačkoli byly změny ve vývoji thymocytů u Lurcher myší zřejmé, v sekundárních lymfatických orgánech nebyly doprovázeny signifikantními změnami v relativní distribuci CD3⁺, CD4⁺ a CD8⁺ T lymfocytů.
Lze se domnívat, že neurodegenerace může narušit homeostatické regulace a vyvolat změny aktivity hypothalamo-pituitárně-adrenální osy a sekundárně hormonální sekrece, které přímo aktivitu thymu ovlivňují. Méně výrazné změny v sekundárních lymfatických orgánech mohou již souviset s alteracemi thymových funkcí. Dokumentované změny v imunitním systému lze s vysokou pravděpodobností přisoudit vlivu progresivní neurodegenerace.
 
ROZSAH FUNKČNÍHO POŠKOZENÍ POTKANŮ, U KTERÝCH BYLA VYVOLÁNA FOKÁLNÍ ISCHEMIE HIPOKAMPU ENDOTHELINEM-1, ZÁVISÍ NA VĚKU A DÁVCE
Mátéffyová A., Otáhal J., Mareš P., Kubová H., Fyziologický ústav AV ČR, Praha. Školitelka: doc.PharmDr Hana Kubová, DrSc.
 
Mozkové ischemické příhody často poškozují paměť. Kromě toho se u pacientů s těmito příhodami může objevit epileptická EEG aktivita, která není doprovázena výraznějšími klinickými projevy.
V naší studii jsme zjišťovali zda ischemická léze hipokampu vyvolaná lokální aplikací endothelinu-1 (ET-1) na různých stadiích vývoje mozku poškozuje kognitivní funkce a vyvolává epileptogenezu. Léze jsme vyvolávali unilaterální intrahipokampální injekcí ET-1 (20 nebo 40 pmol při koncentraci 20 pmol v 0.5 μl) u mláďat potkana 12. (P12) nebo 25. (P25) den po narození. Kontrolní zvířata (sourozenci) dostala stejný objem rozpouštědla (fosfátový pufrovací roztok). Prostorovou paměť jsme testovali v Morrisově vodním bludišti 3 měsíce po vyvolání léze. Poškození této paměti jsme nalezli jen u skupiny P12, stupeň poškození byl závislý na dáve ET-1. Skupina P25 nevykazovala změny prostorové paměti. Po skončení testů v Morrisově bludišti jsme zvířatům implantovali elektrody do mozkové kůry a hipokampu a monitorovali jejich EEG a chvání po dobu 5 dnů. U většiny zvířat jsme zachytili rekurentní nekonvulsivní epileptické záchvaty, byla naznačena závislost na dávce ET-1. Ve skupině P12 byly záchvaty přítomny u 63 a 83 % zvířat, která distala 20, respektive 40 pmol ET-1, ve skupině P25 to bylo 88 a 100 %.
Naše studie ukazuje věkovou závislost kognitivního poškození – prostorová paměť byla postižena ve skupině P12, ale ne u zvířat s lézí 25.den života (P25). V obou skupinách však hipokampové ischemické léze vedou ke vzniku opakovaných epileptických záchvatů.
 
MYELOIDNÍ ANTIGEN CD33 KORELUJE S HORŠÍ PROGNÓZOU AKUTNÍ LYMFOBLASTICKÉ LEUKÉMIE; POTENCIÁL ANTI-CD33 IMUNOTERAPIE
Ester Mejstříková^1,2, Tomáš Kalina^1,2, Jan Trka^1,3, Jan Starý³, Ondřej Hrušák^1,2
1Ústav imunologie UK 2. LF a FN Motol, ²CLIP Childhood Leukemia Investigation Prague, ³Klinika dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN Motol.
Školitel: doc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D.
 
Prognostický význam myeloidních antigenů byl opakovaně studován s rozporuplnými výsledky. Studie buď obsahovaly malý počet pacientů nebo myeloidní antigeny byly sledovány jako celek nebo byli pacienti s T a s B prekurzorovou lymfoblastickou (BCP) leukémií (ALL) studováni společně. Celkem jsme do studie zařadili 327 pacientů léčených podle ALL BFM 95 (medián sledování 3,6 let). Po celou dobu studie byly myeloidní antigeny vyšetřovány identickýn klonem monoklonální protilátky. Multivariantní analýza potvrdila CD33 jako jediný nezávislý prognostický faktor mezi myeloidními antigeny v rámci BCP ALL (p=0,0018). Aberantní exprese na hladině větší nebo rovné 10 % znamenala signifikantně horší 5 leté přežití bez relapsu v rámci BCP ALL (87±3 versus 57±6 %, p=0.00002). V rámci jednotlivých rizikových skupin BCP ALL byl signifikantní rozdíl u pacientů standardního a středního rizika (p=0,010 a p=0,00073), u vysokého rizika rozdíl nebyl signifikantní. Nejvýraznější rozdíl byl ve skupině středního rizika, ve které dochází k největšímu počtu relapsů a ve které jinak predikce relapsu podle standardních kritérií selhává. Srovnání hladiny exprese při diagnóze a při relapsu onemocnění ukazuje výraznou nestabilitu tohoto antigenu. Proto jsme provedli detailní analýzu minimální reziduální nemoci (MRN) u pacientů ve skupině vysokého a středního rizika s expresí CD33 při diagnóze na více než polovině leukemických buněk. U pacientů se zřetelnou reziduální nemocí jsme prokázali stabilitu tohoto antigenu v časné fázi léčby (den 15 a den 33). Domníváme se, že části pacientů by mohla prospět imunoterapie anti CD33 protilátkou již při iniciální léčbě ALL. Práce byla podpořena granty IGA 7430-3 a 6929-3, MSM 0021620813, GAUK 43/2005
 
SEKVENOVÁNÍ GENU EGR2 U 46 ČESKÝCH PACIENTŮ S DEMYELINIZAČNÍ FORMOU CMT ODHALILO NOVOU MISSENSE MUTACI Arg359Gln
Mikešová Emilie, Hühne Kathrin¹, Rautenstrauss Bernd¹, Mazanec Radim², Baránková Lucia², Horáček Ondřej³, Seeman Pavel. Klinika dětské neurologie, ²Neurologická klinika dospělých a ³Klinika rehabilitace UK 2. LF; ¹Institut lékařské genetiky, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen.
Školitel MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
 
Úvod: Gen pro “early growth response factor 2“ (EGR2) kóduje vazebný protein z rodiny zinkových prstů s klíčovou rolí pro myelinizaci periferních nervů. Do dnes bylo celosvětově popsáno pouze 9 mutací genu EGR2 způsobujících kongenitální hypomyelinizační neuropatii, Dejerine-Sottas syndrom nebo demyelinizační typ onemocnění Charcot-Marie-Tooth (CMT1).
Cíl: Určit frekvenci mutací v EGR2 u českých pacientů s demyelinizační formou CMT a rozšířit znalosti o fenotypech způsobených mutacemi v genu EGR2.
Pacienti a metody: Přímým sekvenováním kódující oblasti EGR2 bylo vyšetřeno 46 nepříbuzných pacientů s demyelinizační formou CMT (kriteria výběru: MNCV n.medianus ≤ 40m/s, dominantní / sporadický výskyt, věk při začátku onemocnění 0–50 let). U všech pacientů byla předem vyloučena CMT1A duplikace / HNPP delece.
Výsledky: Identifikovali jsme novou de-novo heterozygotní missense mutaci 1076G>A (Arg359Gln) v rámci vazebné domény EGR2. Pacientem je 17letá žena s CMT1 a výraznou skoliosou. Jde o sporadický případ CMT. Psychomotorický vývoj pacientky byl normální. Ve věku 12,5 roku byl popsán oboustranný pes cavus a od 13 let je patrná porucha chůze. EMG nález je typický pro CMT1 s velmi nízkými rychlostmi vedení motorickými i sensitivními vlákny. BAEP a VEP nevykazují abnormity. Blink reflex je výrazně zpomalen. Mutace Arg359Gln nebyla nalezena u zdravých rodičů a sestry pacientky ani u 69 kontrol vyšetřených restrikční analýzou.
Závěr: Mutace v genu EGR2 jsou detekovatelné zhruba u 2 % českých pacientů s demyelinizační formou CMT. Popisujeme novou mutaci genu EGR2 u pacientky s fenotypem CMT1 a výraznou thorakolumbální skoliosou.
Podpořeno granty VZ 111300003 a IGA MZ ČR.
 
FUNKČNÍ VLASTNOSTI DENDRITICKÝCH BUNĚK PŘIPRAVENÝCH OD PACIENTŮ S KARCINOMEM PROSTATY
Minárik Ivo ^1,2, Špíšek Radek ¹. ¹Ústav imunologie, UK 2. LF, FN Motol, ²Urologická klinika, UK 2. LF, FN Motol.
Školitelé: doc. MUDr. Ivan Kawaciuk, CSc², prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.¹.
 
Karcinom prostaty představuje v mužské populaci velký medicínský problém. V České republice onemocní každý rok 56,8/100 000 mužů, mortalita je kolem 26/100000¹. V dnešní době se se zavedením PSA skríningu většina tumorů odhalí v časných stádiích. I když časná detekce zvyšuje kurabilitu karcinomu prostaty, přesto dojde u 50 % pacientů s nově diagnostikovaným onemocněním k progresi do pokročilého stádia nebo rozvoji metastáz. Jelikož se spektrum pacientů přesunulo z pozdějších stádií do stádií časnějších, setkáváme se mnohem častěji než v minulosti s pacienty, u kterých dochází k relapsu onemocnění po lokální léčbě (15–40 % po radikální prostatektomii). Právě u těchto pacientů není konsenzus, jak přesně postupovat v následné léčbě, jelikož žádný z dosud užívaných postupů nevede k vyléčení, ale pouze prodlužují život za cenu snížené kvality života (např.hormonální terapie). Tento poznatek vede k vývoji nových terapeutických postupů, které by vyléčily, nebo alespoň prodloužily přežití pacientů s ohledem na kvalitu života. Jednou z možností je protinádorová imunoterapie založená na principu indukce imunitní odpovědi dendritickými buňkami (DC buňky). Během prvního roku řešení projektu jsme připravili DC z periferní krve pacientů po radikální prostatektomii. Připravené DC jsme komplexně fenotypicky a funkčně charakterizovali. Nezralé DC buňky pacienta byly připraveny z monocytů periferní krve v přítomnosti GM-CSF a IL-4. Nezralé DC měly nízkou expresi HLA-DR, kostimulačních molekul (CD80 a CD86), v souladu se svým aktivačním stavem měly vysokou schopnost fagocytózy. Po přidání maturačního stimulu (LPS, Poly I:C) se nezralé DC diferencovaly ve zralé DC s odpovídajícími změnami ve fenotypických a funkčních znacích: vzestup CD80, CD86, CD83, HLA-DR, CD11c, snížená schopnost fagocytózy. Stimulované DC produkovaly prozánětlivé cytokiny a IL-12. Zralé DC účinně stimulovaly T lymfocyty. Všechny aktivační změny byly porovnatelné s DC připravenými od zdravých dárců. Dosavadní výsledky analýz poukazují na plně funkční zdatnost DC buněk pacientů s karcinomem prostaty, kteří podstoupili radikální prostatektomii, což je jeden z hlavních předpokladů účinnosti protinádorové vakcíny.
Tato studie je podporována grantem UK č.54/2005 C
 
PREVALENCE ANTIOVARIÁLNÍCH PROTILÁTEK U DOSPÍVAJÍCÍCH PACIENTEK S PORUCHAMI MENSTRUAČNÍHO CYKLU A ŽEN LÉČENÝCH PRO STERILITU.
Mlčochová H. ¹), Hořejší J. ¹), Martínek J. ²), Brandejská M. ³)
¹) Klinika gynekologie dětí a dospívajících UK 2. LF a FNM, ²) Ústav histologie a embryologie UK 1., ³) Gynekologicko-porodnická klinika UK 2. LF a FNM
Školitel: prof. MUDr. Jan Hořejší, DrSc
 
Úvod: Cílem studie bylo zmapovat výskyt antiovariálních protilátek (AOA) u dospívajících s těžkou poruchou menstruačního cyklu v porovnání s dívkami s pravidelným cyklem a vztah mezi pozitivitou AOA protilátek a morfologickými změnami v bioptických vzorcích ovaria pacientek. Zkoumali jsme také pozitivitu antiovariálních protilátek u pacientek zařazených do programu IVF ve folikulární tekutině.
Materiál a metody: Do studie bylo zařazeno 21 dívek s primární amenorheou a oligo/sekundární amenorheou, sledovali jsme výskyt antiovariálních protilátek (proti ooplasma, zona pellucida, buňkám theca interna a luteinním buňkám), hladiny FSH, LH. Současně bylo provedeno imunohistochemické vyšetření biopsií ovarií těchto pacientek. Použity byly de-eponované polotenké řezy, k detekci apoptózy potom především protilátka M 30 CytoDeath. Ultrastrukturální analýza byla provedena pomocí elektronového mikroskopu (EM).
Výsledky: U všech vybraných pacientek s těžkou poruchou menstruačního cyklu byla nalezena pozitivita protilátek proti různým strukturám ovaria. Byla zjištěna signifikantně vyšší hladina FSH což je zřejmě způsobeno nereagujícími ovariálními folikuly; hladina LH nebyla signifikantně vyšší. Deplece a alterace folikulárního aparátu patřila mezi hlavní nálezy v kůře ovaria u našich pacientek. Tomu odpovídal elektronmikroskopický nález terciárních lysosomů v cytoplazmě folikulárních buněk primárních nebo stimulovaných folikulů jako známka vystupňované atrésie v ovariu postižených pacientek. U pacientek zařazených do IVF programu korelovala pozitivita antiovariálních protilátek s neúspěchy jak v zisku, tak fertilizaci oocytů.
Závěr: Mapování výskytu antiovariálních protilátek u pacientek s poruchami menstruačního cyklu koreluje s nálezem vystupňované atresie což vede k vymizení a fibrotizaci kůry ovaria. Nález pozitivity antiovariálních protilátek u pacientek zařazených do IVF programu je spojen s malou úspěšností pacientek v tomto programu. Studie byla podporována grantem IGA č. NH/7663-3.
 
MEMBRÁNOVÉ VLASTNOSTI A IMUNOHISTOCHEMICKÁ ANALÝZA ASTROCYTŮ PO GLOBÁLNÍM ISCHEMICKÉM POŠKOZENÍ MOZKU POTKANA
Neprašová Helena^1,3, Anděrová Miroslava ^1,3, Chvátal Alexandr ^1,3
1Oddělení neurobiologie, Ústav experimentální medicíny AVČR, ³Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, UK 2. LF
Školitelka Ing. Miroslava Anděrová, CSc.
 
Změny membránových vlastností astrocytů a imunoreaktivity pro NeuN, GFAP, nestin a aktivované kaspázy-3 (casp3) byly studovány v hipokampu (CA1 oblast) a v mozkové kůře 8týdenních potkanů po globální mozkové ischemii. Ischemie byla indukována 15minutovou bilaterální okluzí a. carotis com. kombinovanou s hypoxickými podmínkami (6 % O₂ a 94 % N₂) a byla následována 7denní reperfuzí. Metoda patch-clamp v konfiguraci celé buňky byla použita k získání membránových vlastností astrocytů. U kontrolních potkanů i u potkanů po ischemickém poškození vykazovaly astrocyty v kůře i v hipokampu pasivní symetrické K⁺ proudy a současně napěťově závislé vně usměrněné K⁺ proudy (K_DR) a/nebo napěťově závislé dovnitř usměrněné K⁺ proudy (K_IR). Klidový membránový potenciál astrocytů v CA1 oblasti se posunul z –81.2 mV (n=12) u kontrol na –67.2 mV (n=13) po ischemii. Vstupní odpor astrocytů se zvýšil z 58.4 MOhmů v kontrole na 124.5 MOhmů po ischemii a kapacita membrány se zároveň snížila. Navíc se hustota K_DR proudů u CA1 astrocytů zvýšila z 0.07 pA/pF v kontrole na 0.78 pA/pF po ischemii. V CA1 oblasti se po ischemii objevily reaktivní, GFAP/nestin-pozitivní astrocyty, došlo ke snížení NeuN imunoreaktivity a ke zvýšení počtu NeuN/casp3-pozitivních buněk. V mozkové kůře vyvolala ischemie ve srovnání s kontrolou zvýšení GFAP, nestin a casp3 imunoreaktivity, nebyly zde detekovány GFAP/nestin-pozitivní astrocyty a nebyly zjištěny žádné signifikantní rozdíly v membránových vlastnostech astrocytů. Naše výsledky ukazují, že globální mozková ischemie vede ke změnám typickým pro astrogliózu a neuronální poškození pouze v CA1 oblasti hipokampu.
Podporováno granty: GAČR 305/03/1172 , AVOZ50390512, GAUK 57/2005/C/2.LF
 
IDENTIFIKACE B – BUNĚČNÝCH EPITOPŮ PROTEINŮ TEPELNÉHO ŠOKU POMOCÍ METODY WESTERN BLOT
Nguyen Thi Thu Hien ¹, Zlacká Denisa ¹, Vavřincová Pavla ², Sedláček Petr ³, Hromadníková Ilona ^1
1 Pediatrická klinika, ² Dětská poliklinika, ³ Klinika dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol.
Školitel RNDr. Hromadníková Ilona, Ph.D.
 
Proteiny tepelného šoku (hsp) jsou imunologicky dominantní, vysoce konzervativní molekuly (sekvenční homologie až 50 % mezi lidskými a bakteriálními hsp) přítomné u prokaryotních i eukaryotních buněk. Bylo prokázáno, že hsp by mohly hrát roli v etiopatogenezi řady chorob. Pomocí metody ELISA jsme kvantifikovali IgG protilátky proti rekombinantnímu lidskému hsp60 (rh-hsp60), hsp70 (rh-hsp70) a rekombinantnímu Mycobacterium bovis hsp65 (Myc. bovis hsp65) (viz další poster naší skupiny). Western blot (WB) jsme použili jako konfirmační metodu průkazu přítomnosti protilátek.
Anti-hsp protilátky jsme prokázali v sérech dětí léčených transplantací hematopoetických kmenových buněk pro různá maligní i nemaligní hematologická onemocnění. Anti-hsp protilátky byly detekovatelné před zahájením přípravného režimu, během přípravného režimu a po celou dobu po transplantaci včetně časné fáze. Podobně byly také anti-hsp protilátky detekovány v sérech dětí s juvenilní idiopatickou artritidou a zdravých dětí.
Dále se snažíme o průkaz B-buněčných epitopů na jednotlivých hsp.
Myc. bovis hsp65 byl štěpen pomocí bromkyanu (CNBr). Predikce štěpení – 4 fragmenty o 25 kDa (290–534), 17 kDa (1–163), 10.3 kDa (191–285) a 2.9 kDa (164–190) – v místě methioninu. Tricine – SDS PAGE po barvení stříbrem i Coomassie brilliant blue odhalila 4 vzniklé fragmenty: 37 kDa fragment je pravděpodobně produktem nekompletního štěpení; další 3 fragmenty byly získány dle predikce štěpení (25 kDa, 17 kDa, 10.3 kDa). Pomocí WB jsme prokázali, že fragmenty o molekulární hmotnosti 37 kDa, 25 kDa a 17 kDa reagují se sérem pacienta s c-ALL před transplantací . B-buněčné epitopy pro humorální odpovědˇ jsou přítomny v případě pacienta s c-ALL na 25 kDa a 17 kDa fragmentu Myc. bovis hsp65.
 
Tato práce byla podpořena grantem TRANSEUROPE, no. QLRT-2001-01936; Trans-net, no. MRTN-CT-2004-512253 a VZ 111300005.
 
CHODECKÝ TEST V DLOUHODOBÉM SLEDOVÁNÍ SENIORŮ.
Novotná E., Matouš M., Kalvach Z.* KTL a UK 2. LF FN Motol, *3.interní klinika a UK 1. LF a VFN.
Školitel: MUDr. Zdeněk Kalvach CSc.
 
Funkční stav a tělesná aktivita patří mezi významně ovlivnitelné faktory působící na stav organizmu ve stáří. Tělesná aktivita seniorů, kterou představují tréninky chůze, skupinová cvičení a rekondiční pobyty je součástí smysluplné a významné geriatrické prevence.
Cílem naší práce je posoudit výsledky dlouhodobého sledování 2 km chodeckého testu u skupiny seniorů účastnících se rekondičních pobytů a celoročních aktivit Klubu Kardia Motol.
Sledovali jsme skupinu seniorů (n=17) průměrného věku 72 let. Sledovaná skupina byla testována na počátku a na konci sedmidenního rekondičního pobytu a s odstupem dvou resp. tří let.
Výsledky. Během rekondičního pobytu byl čas pro ujití 2 km zkrácen o 10 % resp. 11,2 % (19,3 vs. 19 min; 20 vs. 18,1 min, p<0,01; 20,5 vs. 18,2 min, p< 0,01). S odstupem tří let byl čas prodloužen o 6,2 % (19,3 vs. 20,5 min, p<0,05). Index zdatnosti po třech letech poklesl o 13 % (100 VS. 86, p<0,05), po rekondičním pobytu stoupl o 7 % (100 vs. 107, p<0,05) resp. o 10,6 % (94 vs.104, p<0,05) resp. o 20,9 % (86 vs. 104, p<0,05).
Závěr. Rekondiční pobyt má pozitivní vliv na funkční stav seniorů. Zdatnost vyjádřená chodeckým testem ve sledovaném tříletém období se snižuje, avšak po sedmidenním rekondičním pobytu se dostává na stejnou úroveň jako na počátku sledovaného období. Tyto výsledky svědčí pro udržování funkčního stavu sledovaných seniorů v dlouhodobém sledování.
 
POTLAČENÍ TRANSKRIPTŮ S PŘEDČASNÝMI STOP KODONY (NMD) U PACIENTŮ SE ZÁRODEČNÝMI MUTACEMI V GENU TP53.
Novotná Kamila, Sumerauer David¹, Kodet Roman², Mužíková Kateřina¹, Hilská Irena², Sedláček Zdeněk. Ústav biologie a lékařské genetiky, ¹Klinika dětské hematologie a onkologie, ²Ústav patologie a molekulární medicíny UK 2. LF a FN Motol. Školitel prof. Ing. Zdeněk Sedláček, DrSc.
 
Potlačení transkriptů s předčasnými STOP kodony (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) je mechanismus, kterým se buňka degradací příslušných mRNA brání proti syntéze potenciálně škodlivých předčasně ukončených proteinů. NMD je aktivován jak u mRNA přepisovaných z alel nesoucích mutace typu nonsense nebo frameshift, tak i fyziologicky u některých produktů alternativního sestřihu. Obecně mohou být degradovány všechny mRNA nesoucí STOP kodon následovaný ve vzdálenosti větší než 50–55 nukleotidů místem vložení intronu. Mezi našimi nádorovými rodinami se zárodečnými mutacemi v genu TP53 jsou dvě, které mají mutace typu nonsense, a transkripty z těchto alel jsou kandidáty na NMD. Absence mutovaných mRNA a mutované formy proteinu p53 by ale vylučovaly u přenašečů vznik nádorů mechanismy označovanými jako získání škodlivé funkce a dominantně negativní vliv mutovaného proteinu, které se u genu TP53 předpokládají. Proto jsme se rozhodli prozkoumat fenomén NMD v těchto rodinách. Zjistili jsme, že zatímco v mRNA izolované z lymfocytů periferní krve nosičů mutací nejsou transkripty nesoucí předčasné STOP kodony vůbec přítomny, v nádorech se (v závislosti na ztrátě či retenci heterozygozity na úrovni nádorové DNA) hojně vyskytují. Mutovaný protein p53 se v několika analyzovaných nádorech navíc hromadí velmi neobvykle v cytoplasmě a nikoliv v jádře, což by mohlo souviset s absencí jaderného lokalizačního signálu díky chybění C-konce proteinu. V současné době zkoumáme, zda je v nádorech NMD zcela vypnut. Naše výsledky mají význam jak pro poznání mechanismů karcinogeneze u mutací v genu TP53, tak i jako upozornění na fenomén NMD, který může maskovat některé mutace při analýze mRNA.
 
VLIV MATERIÁLU A VLASTNOSTÍ NITROOČNÍ ČOČKY NA VZNIK OPACIFIKACE ZADNÍHO POUZDRA
Ošmera Jakub. Oční klinika dětí a dospělých UK 2. LF
 
Opacifikace zadního pouzdra (následná, sekundární katarakta, OZP) existuje od počátků extrakapsulární kataraktové chirurgie. Byla obzvláště častá a závažná v počátcích implantací nitroočních čoček, kdy nebyly známy faktory ovlivňující vznik této komplikace a četnost výskytu během 80.let dosahovala 30–50 %. Naše současné údaje ukazují, že při použití moderních technik a čoček klesá předpokládaná míra vzniku OZP a potřeba následné Nd:YAG laserové zadní kapsulotomie k méně než 10 %. Pomineme-li značnou finanční a časovou zátěž zdravotního systému jsou jistě dobrým důvodem pro redukci výskytu OZP nezanedbatelná rizika laserové zadní kapsulotomie.
Cíl práce: Zjistit jak materiál a design nitrooční čočky ovlivňuje vznik a vývoj OZP. Byl sledován mechanismus rozvoje a progrese změn zadního čočkového pouzdra.
Metodika: Během roku 2002 a 2003 jsme na našem pracovišti operovali 48 očí 37 pacientů pro kataraktu. Pacientům byly implantovány 3 typy nitroočních čoček. Pacienti byli zváni v pravidelných intervalech na kontroly a byl zkoumán stav zadního pouzdra čočky. Obraz zadního pouzdra byl zachycen digitální fotografií předního segmentu metodou koaxiální retroiluminace v arteficiální mydriáze. Navíc byla zaznamenána nejlepší korigovaná zraková ostrost a případné subjektivní zhoršení vizu.
Výsledky: OZP různého stupně se objevila u PMMA („tvrdých“) čoček častěji a dříve než u zbylých dvou typů; rovněž intenzita změn a zhoršení zrakové ostrosti byly častější.
Závěr: Je známa řada činitelů ovlivňujících pooperační výskyt OZP. Jedním z hlavních ovlivnitelných faktorů je zcela jistě použitá nitrooční čočka.
Klíčová slova: opacifikace zadního pouzdra, nitrooční čočka, koaxiální retroiluminace
 
REZISTENCE KE GLIVECU – WT1 JAKO MOŽNÝ MARKER, ROLE KINAS JINÝCH NEŽ BCR/ABL
Otáhalová Eva, Moravcová Jana. UHKT Praha.
Školitel RNDr. Haškovec Cedrik
 
Chronická myeloidní leukemie (CML) je charakterizována přítomností hybridního genu BCR/ABL. Léčbou první volby u pacientů s CML se stává Glivec (imatinib mesylate, STI571). Problémem je existence primární a také sekundární rezistence, vznikající v průběhu léčby. Bylo prokázáno, že rezistence je způsobena mutacemi ve vazebné smyčce pro ATP, amplifikací genu BCR-ABL, případně zapojením kinas rodiny Src, které mohou přebírat roli BCR/ABL v patogenezi buňky. Potencionálním markerem primární rezistence CML pacientů ke Glivecu a prognostickým markerem CML se zdá být gen WT1 (Wilms’ tumor suppressor gene).
V naší studii byly k určení primární rezistence prováděny krátkodobé in vitro kultivace primárních buněk s Glivecem. Byly použity leukocyty izolované z periferní krve BCR/ABL pozitivních CML pacientů před i během léčby Glivecem (n>30) a BCR/ABL pozitivní buněčná linie K562. Jako negativní kontrola byly užity buňky BCR/ABL negativní – leukocyty zdravých dárců, AML pacientů a buněčná linie ML2. K určení exprese jednotlivých genů bylo použito metod kvantitativní RT-PCR.
V případě BCR/ABL pozitivních buněk (linií K562 a leukocytů většiny CML pacientů) vedla inkubace s Glivecem (koncentrace 1μM vybrána pro srovnávání výsledků) k inhibici růstu, snížení proliferační schopnosti, zvýšené indukci apoptosy a snížení exprese genů BCR/ABL a WT1. U kontrolních buněk tento jev pozorován nebyl. Leukocyty pacientů, u kterých nebyl in vitro zjištěn inhibiční vliv Glivecu, nebo kteří se stali rezistentní k léčbě Glivecem, byly následně inkubovány s inhibitory kinas rodiny Src, Jak a dalších. Zde došlo ke snížení proliferační schopnosti i expresi sledovaných genů.
Získané výsledky naznačují možnost využití exprese genu WT1 k určení primární rezistence CML pacientů k léčbě Glivecem. Výsledky dále naznačují, že u rezistentních pacientů mohou alespoň částečně roli BCR/ABL přebírat jiné proteinkinasy.
 
MULTIMODÁLNÍ LÉČBA KARCINOMU PANKREATU
Polouček Petr, Chirurgická klinika UK 2. LF a FNM.
Školitel: doc. MUDr. J. Leffler, Csc.
 
Cíl práce: sledování vlivu podávané systémové enzymoterapie – SET (Wobe-Mugos^R )
na přežívání pacientů s karcinomem pankreatu.
Metodika: Pacienti s karcinomem oblasti hlavy pankreatu, indikovaní k operaci , jsou předoperačně dle rodných čísel randomizováni do skupiny SET a do skupiny placebo. Pooperačně jsou sledováni v intervalech 3 měsíců (klinická nález, laboratorní parametry, UZ jater a podjaterní krajiny.) V závislosti na zařazení pacientů do skupiny SET a placebo následně srovnáváme průměrnou dobu přežití.
Výsledky: v letech 2000–2004 bylo operováno 98 pacientů s tumorem oblasti hlavy pankreatu. Kriterium zařazení do studie (souhlas pacienta, histologická verifikace, nepřítomnost vzdálených metastáz v době operace)
splnilo 52 pacientů. Radikální výkon byl proveden 39 pacientům (4 pacienti byli následně vyřazeni ze sledování). Průměrná doba přežití u pacientům s perioperačním podáváním SET byla 16.5 měsíce, u skupiny placebo pak 20 měsíců.
Závěr: z našich předběžných výsledků zatím vyplývá, že podávání SET pacientům, kterým byl proveden radikální výkon (resekce části slinivky s tumorem) přežívání neprodlužuje.
 
CHARAKTERIZACE ATYPICKÉ PŘESTAVBY V OBLASTI 17p11.2-12 S DUPLIKACÍ PMP 22 GENU U RODINY S CHOROBOU CHARCOT-MARIE-TOOTH TYP 1A
Posádka J.¹, Sakmaryová I.¹, Zapke V.² Mikešová E.¹, Hühne K.², Rautenstrauss B.² Seeman P.¹¹Klinika dětské neurologie UK 2. LF a FNM, ²Institut für Humangenetik Universität Erlangen
Školitel: MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
 
Úvod: Choroba Charcot-Marie-Tooth (CMT) je geneticky heterogenní skupinou relativně častých dědičných neuropatií, projevující se progresivní slabostí distálních svalů končetin. Nejčastější forma CMT1A, je způsobena duplikací v oblasti 17p11.2-12 zahrnující gen PMP22. Rozsah CMT1A duplikace je u většiny pacientů uniformní.
Cíle: Charakterizovat rozsah atypické CMT1A duplikace v rodině s projevy demyelinizační neuropatie, u které výsledky vyšetření mikrosatelitových markerů svědčily spíše pro deleci v oblasti, ale real time PCR prokázala přítomnost 3 kopií PMP22 genu. Sestavit mapu poloh všech 36 dostupných a známých mikrosatelitových markerů v 1,4 Mb oblasti CMT1A.
Materiál and metody: Testovali jsme 4 členy (3 postižené CMT1 a jednoho zdravého) zmíněné rodiny pomocí 20 informativních polymorfních mikrosatelitových markerů z této oblasti. Mapa markerů byla sestavena zadáním sekvencí primerů všech markerů do database BLAST.
Výsledky: Sestavili jsme mapu všech známých mikrosatelitových markerů v oblasti 17p11.2-12 s jejich absolutními pozicemi. Pomocí této mapy jsme specifikovali rozsah atypické přestavby u vyšetřované rodiny přičemž jsme v oblasti CMT1A nalezli úseky s delecí, duplikací i normálním počtem kopií. Díky sestavené mapě markerů jsme zjistili, že u dvou dvojic nezávisle publikovaných markerů D17S2227 a Lat9A; a D17S2226 a Lat9B jde ve skutečnosti o identickou repetici v genomu.
Závěr: Výsledky u vyšetřené rodiny ukazují vzácnou možnost zřejmě velmi komplexního vzniku atypické CMT1A duplikace. Přesná charakterizace míst zlomů je předmětem naší další práce. Objev identity u dvou dvojic markerů D17S2227 a L9A a D17S2226 a L9B je významný pro diagnostiku CMT1A.
Podpořeno z grantu GA UK 72/2004C a IGA MZ ČR 1A 8254-3.
 
EXTRACELLULAR SPACE DIFFUSION PROPERTIES IN CORTICAL SLICES OF TENASCIN-R KNOCKOUT MICE
Rafiq Amir, Vargová Lýdia, Syková Eva. Ústav neurověd UK 2. LF a Odd. neurověd, Ústav experimentální medicíny AVČR.
Školitel prof. MUDr. Eva Syková, DrSc.
 
The extracellular matrix glycoprotein tenascin-R has been implicated in the control of axonal targeting and neural cell adhesion, migration and differentiation. Our previous in vivo study suggested a role for tenascin-R in maintaining tissue structure and a stable extracellular space (ECS) volume¹. The aim of the current study was to confirm these results in vitro and to further study how tenascin-R molecules might affect cell swelling and its regulation. The measurements were done in cortical slices of adult mice using the real-time iontophoretic method with tetramethylammonium (TMA⁺)-selective microelectrodes. This method determines the absolute values of three ECS diffusion parameters: volume fraction α (α = ECS volume/total tissue volume), tortuosity $lambda; ($lambda;²= free/apparent diffusion coefficient) and non-specific uptake k´, representing the loss of diffusing molecules. In tenascin-R deficient (TN-R –/–) mice, α was significantly reduced in comparison with controls (TN-R +/+): 0.14 ± 0.01 (mean ± S.E.M.) and 0.21 ± 0.01, respectively, while $lambda; was not significantly different: 1.52 ± 0.01and 1.53 ± 0.01, respectively. The application of 50mM K⁺ for 30 min resulted in a decrease in α of ~40 % and an increase in $lambda; to 1.7–1.8 in both TN-R –/– and TN-R +/+ slices. 10mM K⁺ evoked a similar decrease in α (of ~40 %) in TN-R –/– slices, but only a ~20 % decrease in TN-R +/+ slices. The tortuosity increased to 1.68 and 1.84, respectively, following the application of 10mM K⁺.
Our results confirm a smaller ECS volume in TN-R –/– animals in comparison with controls in vitro. The data also indicate the reduced capacity of cells in TN-R –/– slices to regulate their volume. We suggest that tenascin-R plays an important role in tissue structure and ECS volume maintenance and that its absence may have a strong impact on the diffusion of neuroactive substances and non-synaptic communication. Supported by AVOZ 503 90512 and 1M0021620803.
¹Voříšek I et al, 2003, Abstract ISMRM, Toronto.
 
VLIV GLUKOKORTIKODŮ NA EXPRESI TOLL-LIKE RECEPTORŮ U DENDRITICKÝCH BUNĚK.
Daniela Rožková, Radek Špíšek, Jiřina Bartůňková
Ústav imunologie, UK 2. LF, FNM (@email)
 
Dendritické buňky (DC) jsou účinné antigen presentující buňky (APC) stojící v první linii obrany imunitního systému proti patogenům. DC exprimují Toll-like receptory (TLR), jimiž jsou rozpoznávány pro patogeny charakteristické molekulární struktury. Při setkání s patogenem jsou spuštěny signalizační dráhy vedoucí k morfologickým, fenotypickým a funkčním změnám (tzv. maturaci), při kterých dochází ke kompletní přeměně nezralých buněk na profesionální APC. Proces maturace je pozitivně i negativně regulován řadou substancí. Glukokortikoidy (GC) jsou přirozeně produkované hormony, jejichž syntetické analogy jsou rutině používány při léčbě alergických, autoimunitních a některých maligních onemocnění. Cílem studie bylo objasnit vliv glukokortikoidů na proces maturace dendritických buněk připravených z monocytů. Nezralé dendritické buňky byly po působení TLR ligandů podrobeny funkční a fenotypické analýze. Glukokortikoidům vystavené DC vykazovaly sníženou expresi pro maturaci typických znaků (CD80, CD86, CD83, HLA). Buňky si navzdory přítomnosti maturačních stimulů udržely vysokou fagocytární aktivitu a sníženou stimulační kapacitu v testech alogenní MLR. Naměřené nízké hladiny IL-12 p70 a naopak vysoké hladiny IL-10 dále podpořily hypotézu snížené schopnosti DC maturovat. Kvantitativní měření mRNA u GC ovlivněných buněk prokázalo signifikantní nárůst exprese TLR2, TLR3 a TLR4. Po působení GC však nebyla nalezena zvýšená povrchová exprese TLR proteinů a na základě stanovení hladin produkovaných cytokinů byla prokázána přetrvávající snížená maturační kapacita DC. Prezentovaná data ukazují na existenci dalších mechanismů účinků GC na vrozenou složku imunitního systému. Další studie se zaměří na odhalení molekulárních principů a fyziologického významu diskrepance mezi zvýšenou expresí TLR na úrovni mRNA a sníženou schopností DC indukovat imunitní reakci po ovlivnění GC.
Tato studie je podpořena granty: IGA MZ NI/7537-3, GAUK 73/2004/C/2.LF
 
STIMULACE MONONUKLEÁRNÍCH BUNĚK PERIFERNÍ KRVE PROTEINY TEPELNÉHO ŠOKU U PACIENTŮ INDIKOVANÝCH K TRANSPLANTACI KMENOVÝCH BUNĚK
Sedláčková Lucie ¹, Sedláček Petr ², Hromadníková Ilona ¹. ¹Laboratoř buněčné biologie, Pediatrická klinika a ²Klinika dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN v Motole.
Školitel RNDr. Ilona Hromadníková, Ph.D.
 
Proteiny tepelného šoku (hsp) jsou vysoce konzervativní molekuly. Za fyziologických podmínek jsou přítomny v nízkých koncentracích v cytoplasmě. Při buněčném stresu se však jejich exprese zvyšuje. Hsp se podílí na stabilizaci proteinů a jejich transportu mezi intracelulárními kompartmenty a představují hlavní imunodominantní antigeny u širokého spektra mikrobiálních patogenů. Jejich předpokládaná role ve vazbě peptidů a antigenní prezentaci představuje potenciální roli v aloreaktivním procesu vedoucím ke vzniku reakce štěpu proti hostiteli, hlavní komplikaci po alogenní transplantaci kmenových buněk (SCT). Předmětem našeho studia je měření proliferace mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) na stimulaci rekombinantním lidským hsp60, hsp70 a Mycobacterium bovis hsp65 ve vztahu k akutní GVHD (graft-versus-host disease) a infekci u dětí s různými maligními a nemaligními hematologickými onemocněními indikovanými k SCT. Předběžné studie ukázaly signifikantně vyšší odpovědi na rh-hsp60 a M. bovis hsp65 u pacientů s anamnestickou a/nebo aktuální infekcí (kolonizace, sepse) v závislosti na etiologickém agens (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae) ve srovnání s pacienty bez známek infekce a se zdravými dárci. U pacientů s akutní GVHD byla zjištěna signifikantně nižší proliferační odpověď na rh-hsp60, rh-hsp70 a M. bovis hsp65 ve srovnání s pacienty, u kterých se GVHD nevyskytla. Nižší stimulace PBMC pacienta proteiny tepelného šoku během manifestace akutní GVHD by mohla být vysvětlena aktivací regulačních/supresorových Tr (Th3) lymfocytů jako důsledek nadměrné exprese vlastních hsp v souvislosti se zánětlivou reakcí ve tkáních postižených GVHD.
Práce byla podpořena grantem TRANSEUROPE, no. QLRT-2001-01936 a VZ 111300005.
 
BIOPSIE SENTINELOVÉ UZLINY V CHIRURGICKÉ LÉČBĚ KARCINOMU ŽALUDKU: VÝSLEDKY PROSPEKTIVNÍ STUDIE.
Šimša Jaromír, Leffler Jan, Chirurgická klinika UK 2. LF a FN Motol
Školitel: doc. MUDr. Jan Leffler, CSc.
Úvod: Optimální rozsah lymfadenektomie v chirurgické léčbě karcinomu žaludku zůstává stále jednou z diskutovaných otázek. Vliv extenzivních výkonů na zlepšení přežívání nebyl zatím jednoznačně prokázán. Biopsie sentinelové uzliny by se mohla stát vhodnou metodou pro detekci uzlinového postižení a tedy i pro stanovení optimálního rozsahu lymfadenektomie. Cílem studie je ověření spolehlivosti biopsie sentinelové uzliny u nemocných s karcinomem žaludku.
 
Materiál a metody: Prospektivní, unicentrická, klinická studie. Sentinelová uzlina je identifikována s pomocí vitálního barvení. Po provedení laparotomie je provedena aplikace patentní modři v množství 2ml, podél makroskopického okraje nádoru do submukózy. Všechny první modře zbarvené uzliny jsou odebrány a peroperačně histologicky vyšetřeny. Následuje provedení D2 lymfadenektomie a detailní histopatologické vyšetření všech lymfatických uzlin včetně imunohistochemie.
 
Výsledky: Během období čtyř let bylo na naše pracoviště přijato celkem 46 nemocných s karcinomem žaludku. Aplikace barviva a pokus o identifikaci sentinelové uzliny byly provedeny u 26 osob. Spolehlivé výsledky metody jsme pozorovali u menších tumorů (průměr do 7 cm) a časných stádií onemocnění (I-IIIa UICC 1997). U velkých nádorů a pokročilých stádií docházelo k difůznímu modrému nabarvení žaludku i přilehlého tuku, což znemožňovalo identifikaci sentinelové uzliny. Peroperační histologické vyšetření sentinelové uzliny bylo u dvou nemocných falešně negativní, mikrometastázy v těchto uzlinách prokázalo až definitivní vyšetření.
 
Závěr: Biopsie sentinelové uzliny u karcinomu žaludku s použitím vitálního barvení je metodou technicky proveditelnou. Spolehlivé výsledky jsme pozorovali u malých tumorů a časných stádií onemocnění.
 
PROTILÁTKY PROTI FRAGMENTŮM CYTOSKELETU U PACIENTŮ S VASKULÁRNÍ, SMÍŠENOU, PRIMÁRNĚ NEURODEGENERATIVNÍ DEMENCÍ A CJD.
Škoda D., Vyhnálek M., Kranda K., Bojar M., Hort J., Glosová L., Laczo J.
Neurologické oddělení, 2. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze
 
Cíl studie: Objasnit, zda tvorba je možné na základě titrace protilátek proti fragmentům neuronálního cytoskeletu u pacientů s demencí odlišit postižení degenerativní etiologie od vaskulárního.
Metodika: Soubor 35 pacientů se syndromem demence diagnostikovaných dle kritérií DSM IV obsahoval: 4 pacienty s Alzheimerovou chorobou, 9 s vaskulární demencí (VD), 8 se smíšenou demencí, 8 s frontotemporální demencí, 2 pacienty s demencí s Lewyho tělísky, 2 pacienty s Creutzfeld Jakobovou chorobou a 2 pacienty s demencí při Parkinsonově chorobě. Na základě klinického vyšetření, zobrazovacích a laboratorních metod (MRI, fosfo-Tau, Tauprotein, beta-amyloid) byly pacienti rozděleni do 3 skupin – primárně neurodegenerativní (n=18), vaskulární (n=9) a smíšená demence (n=8) . Do skupiny primárně atroficko – degenerativních byli zavzati jen pacienti s Hachinski skóre pod 4. Séra a mozkomíšní moky těchto pacientů byly testovány na přítomnost specifických protilátek proti neuronálnímu cytoskeletu (třídy IgM+IgG), mikrotubulární podjednotky – beta tubulinu (btcIII) pomocí ELISA.
Výsledky: Pozitivní titry protilátek proti btcIII jsme testováním zjistili u 78 % pacientů s VD, u 75 % pacientů se smíšenou demencí a pouze u 39 % pacientů s čistým neurodegenerativním postižením. Ze souboru 35 pacientů mělo v mozkomíšním moku pozitivní titry 5 a v séru 32 pacientů.
Závěr: Tvorba protilátek proti fragmentům cytoskeletu je signifikantně častěji detekovatelná u pacientů s vaskulární a smíšenou demencí než u pacientů s degenerativní demencí (p<0,05). Podkladem je antigenní stimulace cytoskeletálními fragmenty uvolněnými při nekróze neuronů. Výsledky podporují, že testování na přítomnost těchto specifických protilátek může být použito v diferenciální diagnostice primárně neurodegenerativní a vaskulární demence.
Tato studie byla podpořena granty GAČR 309/05/0693 a IGA, NR8114
 
1H MR SPEKTROSKOPIE HIPOKAMPU POTKANA VE STÁŘÍ A PO STRESU
Šlais K.¹, Jirák D. ^2,3, Voříšek I.^1,2, Burian M. ^2,3, Hájek M.^2,3, Syková E.^1,2
1.Oddělení neurověd, Ústav experimentální medicíny, AVČR, Praha, ².Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, 2. lékařská fakulta, Karlova Univerzita, Praha
³.Oddělení radiodiagnostiky a intervenční radiologie, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha
 
Úvod: Hipokampus je klíčovou struturou mozku v mechanizmech učení a paměti a ve zpětnovazebné regulaci stresové odpovědi. Dlouhodobé působení stresu může poškodit regulaci v ose hyppothalamus-hypofýza-nadledviny s následným poškozením kognice ve stáří. Jiné teorie předpokládají, že stárnutí zhoršuje regulační schopnost hipokampu a zvýšené hladiny kortikoidů pak dále poškozují strukturu i funkci hipokampu. V naší práci jsme sledovali změny metabolitů v hipokampu ve stáří nebo po dlouhodobé aplikaci kortikoidů metodou 1H MR spektroskopie.
Metoda: Změny ve stáří byly zkoumány u potkaních samců starých 22 měsíců (n=10) a 4 měsíce (n=6). Změny po dlouhodobé (21 dnů) aplikaci kortikosteroidů byly sledovány u 20 potkaních samců starých 4 měsíce, kterým byly aplikovány 150 mg (n=8) nebo 300 mg (n=8) pelety kontinuálně uvolňující kortikosteron nebo placebo (n=4). 1 H spektra levého i pravého hipokampu (celkový objem 35 mm³) byla změřena 4.7 T Bruker MR spektrometrem. Koncentarce metabolitů byly stanoveny metodou LC modelu (1). Data byla statisticky zpracována t-testem.
Výsledky: U 22 měsíců starých potkanů se signifikantně zvýšila koncentrace ve vodě rozpustného cholinu a inositolu proti skupině mladých zvířat. U koncentrací kreatinu, glutamátu a N-acetyl-aspartátu nebyly signifikantní rozdíly mezi mladými a strarými zvířaty. U zvířat po chronické aplikaci kortikosteronu nebyly zaznamenány signifikantní změny v koncentracích sledovaných metabolitů.
Diskuse a závěr: Ve skupině starých zvířat je zvýšená koncentrace cholinu u starců ve shodě s publikovanými výsledky. (2) Zvýšení inositolu, markeru astroglie, může naznačovat zvýšené reparační pochody a astrogliózu v poškozeném hipokampu. Aplikace kortikosteronu po dobu 21 dnů nestačila vyvolat poškození, které by se odrazilo ve změně sledovaných metabolitů v hipokampu, bylo by proto vhodné stanovit změny po dlouhodobějším působení kortikoidů, nebo u starších zvířat, která jsou k poškození kortikoidy více vnímavá.
 
Reference:
1) Prowencher SW. Estimation of metabolite concentrations from localized in vivo proton NMR spectra. Magn Reson Med. 1993 Dec; 30(6): 672–9.
2) Katz-Brull R, Koudinov AR, Degani H. Choline in the aging brain. Brain Res. 2002 Oct 4; 951(2): 158–65.
 
INTERAKCE PRODUKCE OXIDU DUSNATÉHO A KYSLÍKOVÝCH RADIKÁLŮ PŘI PLICNÍ VAZOKONSTRIKCI
Šnorek M., Brtnický T.
Ústav fyziologie UK 2. LF a Centrum experimentálního výzkumu chorob srdce a cév
Školitel: MUDr. Daniel Hodyc
 
Plicní vazokonstrikce při akutní ventilační hypoxii je ovlivňována vzájemnou interakcí produkce oxidu dusnatého (NO) a kyslíkových radikálů. Inhibiční působení antioxidantů – v této studii použitého SOD mimetika, Tempolu, na hypoxickou plicní vazokonstrikci může být způsobeno dvěma mechanismy:
1. inhibicí produkce superoxidu nutného k reakci s NO snížíme tvorbu peroxinitritu, čehož důsledkem je oslabená vazokonstrikční odpověď.
2. menší produkce superoxidu jako substrátu vede ke snížené spotřebě NO nutného k tvorbě peroxinitritu. Vyšší koncentrace NO má následně vazodilatační účinek.
Porovnávali jsme vazokonstrikční odpověď před a po podání Tempolu (50mg/kg) do perfuzního roztoku (skupina I, n=5). Pro objasnění efektu koncentrace NO na vazokonstrikční odpověď jsme jeho produkci inhibovali podáním L-NAME (5x10^–5 mol/l) do perfuzátu na počátku experimentu, opět jsme porovnávali intenzitu vazokonstrikčních odpovědí na podání Tempolu (skupina II, n=6).
Pro experiment jsme použili preparát izolovaných plic laboratorního potkana kmene Wistar perfundovaných konstantním průtokem 0,04 ml/min/g solným roztokem s 4% albuminem a meklofenamátem. Plíce byly ventilovány vzduchem s 5 % CO₂, vazokonstrikce byla vyvolána akutní ventilační hypoxií (0 % O₂ + 5 % CO₂ +95 % N₂) a bolusovým podáním angiotenzinu II (0,2µg).
Zjistili jsme, že podání Tempolu u obou skupin signifikantně snížilo vazokonstrikční odpověď vyvolanou ventilační hypoxií i angiotenzinem II., vazokonstrikční odpověď po podání Tempolu není ovlivněna přítomností L-NAME v perfuzátu (sk.I: 0,4±0,1 torr a sk.II: –0,1±0,3 torr [P=0,163] při hypoxické vazokonstrikci).
Závěr: SOD mimetikum Tempol inhibuje hypoxickou plicní vazokonstrikci nezávisle na aktuální koncentraci NO, tedy nejspíše cestou přímé eliminace působení kyslíkových radikálů snížením jejich koncentrace.
 
PŘÍNOS ZOBRAZOVACÍCH METOD A VYŠETŘENÍ MOZKOMÍŠNÍHO MOKU V DIAGNOSTICE SUBARACHNOIDÁLNÍHO KRVÁCENÍ
Strohm K., Mociková M., Neurologická klinika,
Školitelé doc. MUDr. Martin Bojar, CSc., doc. MUDr. Jaroslav Jeřábek, CSc.
 
Typickým příznakem subarachnoidálního krvácení (SAK) je náhlá prudká bolest hlavy s možnou poruchou vědomí. Současně se může objevit neurologický deficit různého stupně v závislosti na tíži a lokalizaci SAK jako následek bezprostřední léze mozku způsobené krvácením nebo sekundárního ischemického poškození CNS při spasmu cév.
V některých případech může být průběh krvácení značně odlišný od typického obrazu SAK.
39 letý muž, několik let léčen pro arteriální hypertensi, vyhledal praktického lékaře z důvodu náhlé vzniklé prudké pulsující bolesti hlavy a bolesti šije, které se objevily v klidu. V průběhu 3 týdnů se toto opakovalo čtyřikrát. S diagnosou cervikokraniální syndrom byl odeslán na rehabilitační léčbu. Bolesti hlavy a šije postupně odeznívaly, avšak po dvou týdnech se náhle objevila spastická paréza pravé dolní končetiny, která způsobila pád. Akutně byl hospitalizován na JIP.
Provedená vyšetření CT, MRI mozku a mozková panangiografie prokázala mozkové aneurysma na a.communicans anterior při odstupu od a. cerebri anterior dx. Likvorologické vyšetření proběhlé krvácení potvrdilo.
Příznaky subarachnoidálního krvácení mohou být zcela netypické. Stává se, že v popředí je bolest krční nebo bederní páteře, což je způsobeno drážděním míšních kořenů krví v subarachnoidálních prostorech páteřního kanálu.
V případě sledovaného pacienta byla paréza pravé dolní končetiny způsobena pozdní ischemickou lézí.
Právě tyto odlišné klinické obrazy je nutno vždy zohlednit v diferenciální diagnostice SAK.
 
MAPOVÁNÍ STRUKTURY PÓRU VANILOIDNÍHO RECEPTORU TRPV1
Sušánková Klára¹, Teisinger Jan¹, Vyklický Ladislav¹, Viana Félix², Ettrich Rüdiger³, Vlachová Viktorie¹. Fyziologický ústav Akademie věd, Praha, Česká Republika, ²Ústav neurověd, UMH-CSIC, San Juan de Alicante, Španělsko, ³Ústav fyzikální biologie Jihočeské univerzity a Ústav ekologie krajiny Akademie věd ČR, Nové Hrady, Česká Republika.
Školitelka RNDr. Viktorie Vlachová, DrSc.
 
Vaniloidní receptor je neselektivní kationtový kanál exprimovaný převážně primárními nociceptory. Je aktivován podněty, jež vyvolávají bolest u člověka, a to nejen chemickými (kapsaicinem, protony a mediátory zánětu), ale také fyzikálními (tepelným podnětem > 43°C). Struktura TRPV1 receptoru, charakteristická pro rodinu TRP (transient receptor potential) kanálů, je tvořena šesti transmembránovými doménami (S1–S6), hydrofóbní kličkou spojující oblast S5 a S6 (tzv. P-loop) a N- a C- konci směřujícími intracelulárně. Receptor se v plazmatické membráně vyskytuje převážně jako homotetramer.
Cílem naší studie byla bližší charakterizace molekulární architektury póru TRPV1 kanálu, na jehož stavbě se podílí S5-P-S6 úsek všech čtyř podjednotek vaniloidního receptoru, a objasnění úlohy této funkčně významné oblasti kanálu v iontové selektivitě, propustnosti a řízení aktivity iontového kanálu. Podle předvídané struktury a porovnáním primární sekvence oblasti póru s příbuznými kanály TRPV5, TRPV6 a KcsA jsme vytipovali tři aminokyseliny (M644, D646, E648), které jsme metodou PCR mutageneze jednotlivě zaměnili za cysteiny. Wild-type a patřičné konstrukty TRPV1 receptoru byly heterologně exprimovány v HEK293T buňkách a odpovědi vyvolané kapsaicinem (1 µM), tepelným podnětem (47 °C) a kombinací obou stimulů byly snímány elektrofyziologickou technikou patch clamp a technikou zobrazení změn koncentrace intracelulárního vápníku.
Získaná data prokázala funkční změny v aktivaci mutovaných receptorů M644C, D646C a E648C a v souladu s navrženým 3D modelem sekvence póru TRPV1 (E570-E694) naznačují, že uvedené tři aminokyseliny jsou lokalizovány v kritické oblasti póru určující iontovou propustnost a řízení funkce vaniloidního receptoru.
 
ANALÝZA CHŮZE U PACIENTŮ S DĚTSKOU MOZKOVOU OBRNOU
Švehlík M. 2. Ortopedická a traumatologická klinika dětí a dospělých UK 2. LF, Školitel: doc. MUDr.Tomáš Trč, Csc.
 
Úvod: Dětská mozková obrna je jedním ze závažných onemocnění v dětství. Incidence je v ČR 1/2000 živých novorozenců, tzn. že je u nás kolem 20 000 takto postižených dětí do 15 let věku.
Cíle: Cílem námi navrhovaného projektu je průkaz, že jednodobé víceetážové operace na měkkých tkáních, které jsou určené ke korekci deformit dolních končetin u dětí s DMO, vedou nejen ke zlepšení biomechanických parametrů chůze, ale i k funkčnímu zlepšení kvality chůze, reprezentovanému snížením její energetické náročnosti.
Materiál a metodika: Do této pilotní studie bude zařazeno 10 dětí s formou DMO diparesis spastica. Evaluace chůze bude provedena: 1) klinicky společně s videozáznamem chůzového stereotypu pacienta, 2) pomocí dotazníku The Functional Mobility Scale (FMS), 3) kinematografickou 3D analýzou chůze a 4) energetická náročnost chůze bude stanovena pomocí VO_2max, energy expenditure index (EEI) a physiological cost index (PCI), získaných měřením vydechovaných plynů a srdeční frekvence při zatížení pacienta chůzí na chodícím pásu. Měření budou provedena předoperačně a poté 9 měsíců po operaci. V době 3 měsíce po operaci bude navíc provedeno klinické hodnocení chůze, dotazník FMS a 3D kinematografická analýza chůze.
Předpokládané výsledky: Dle doposud publikovaných prací očekáváme zlepšení sledovaných biomechanických parametrů chůze: zvýšení rychlosti, prodloužení kroku a s tím spojené zvýšení rozsahu kloubní hybnosti, snížení kadence a zkrácení doby dvojí opory značící zlepšenou stabilitu při chůzi. Tyto výsledky by měly být v korelaci s výsledky zátěžového vyšetření, kde očekáváme snížení hodnoty EEI (O2) a PCI a naopak nárůst VO_2max. Zlepšení by mělo být evaluováno také vyšším skóre v FMS.
Závěr: Tento projekt je koncipován jako pilotní studie pro získání základních dat a ověření metodiky.
 
HYPERODONTIA FRONTÁLNÍHO ÚSEKU MAXILLY
Švermová D., Benešová H..
Dětská stomatologická klinika FN Motol a UK 2. LF.
Školitel doc. MUDr. Jiří Kozák, CSc.
Tématem příspěvku je problematika hyperodoncie ve frontálním úseku horní čelisti.
Ve sdělení jsou popsány možnosti lokalizace a tvary korunek nadpočetných zubů. Dále jsou definovány důvody, proč je důležité zabývat se problematikou nadpočetných zubů. Jsou to zjeména komplikace, které způsobují. Vzhledem ke komplikacím upozorňueme na nutnost včasné diagnosy hyperodoncie a na diferenciální diagnosu. Zmiňujeme i pomocná vyšetření – rtg. Zvláštní pozornost je věnována pacientům s rozštěpovou anomalií. Závěrem zmiňujeme možnosti terapie hyperoncie a zdůrazňujeme nutnost mezioborové spolupráce.
 
IMUNOTERÁPIA OVARIÁLNEHO KARCINÓMU DENDRITICKÝMI BUNKAMI: IN VITRO ŠTÚDIE
Tobiásová Z.¹, Pospíšilová D.¹, Špíšek R.¹, Rob L.², Bartůňková J. ^1
1 Ústav imunologie UK 2. LF a FN Motol a ² Gynekologicko-pôrodnická klinika UK 2. LF a FN Motol,
Školiteľ: prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.
Ovariálny karcinóm patrí k závažným nádorovým ochorením u žien vďaka svojho takmer bezpríznakového charakteru v skorých štádiach a svojej vysokej mortalite.
Dendritické bunky sú jedinečné antigen prezentujúce bunky s vysokou schopnosťou aktivovať naivné T lymfocyty. Sú vyžadovaným nástrojom imunoterapie, ktorá je nádejnou perspektívou medzi protinádorovými terapiami.
Cieľom nášho projektu je vytvorenie vhodných metodických postupov na prípravu DC vakcíny pre využitie v klinickej praxi.
V experimentoch ovariálne tumorové bunky boli získané z ascitu v dobe chirurgického zákroku. Apoptotické tumorové bunky boli použité ako zdroj tumorových antigénov. Dendritické bunky boli získané z monocytov periférnej krvi pacientiek kultiváciou v prítomnosti cytokínov GM-CSF a IL-4 6 dní. Pulzácia nematurovaných dendritických buniek bola vykonaná apoptotickými telieskami tumorových buniek. Maturácia bola dosiahnutá Poly I:C.
Zmeny vlastnosti DC po pulzácii a maturácii oproti nematurovaným DC (iDC) boli sledované fenotypizáciou DC pomocou povrchových znakov. Schopnosť fagocytózy DC bola testovaná pomocou konfokálnej mikroskopie. Kinetika apoptózy tumorových buniek bola sledovaná pomocou annexínu a propídium-jodidu. Schopnosť DC aktivovať autológne T lymfocyty bola monitorovaná proliferačným testom a IFN-γ produkcia tumor-antigén špecifickými lymfocytami pomocou ELISPOTu. Produkcia cytokínov dendritickými bunkami bola meraná ELISA kitom.
Vzorky ascitu a periférnej krvi sme získali od 20 pacientiek. Kultivácia iDC bola úspešná u všetkých pacientiek. Maturácia pulzovaných DC bola dosiahnutá u 7 pacientiek z 10. Proliferačné testy boli vykonané u 7 pacientiek, v 5 prípadoch s vhodnou odpoveďou. Niekoľkonásobné zvýšenie produkcie IFN-γ sme sledovali u 4 pacientiek z 5. Naše závery poukazujú na vhodnosť použitých metodík na získavanie tumorových antigénov a prípravu DC, tiež pulzácie a maturácie.
 
VĚKOVÉ ZMĚNY FREKVENČNÍ POTENCIACE A DEPRESE TRANSKALOSÁLNÍCH ODPOVĚDÍ U POTKANŮ, U NICHŽ BYL VYVOLÁN STATUS EPILEPTICUS
Tsenov G., Mareš P., Fyziologický ústav AV ČR, Praha.
Školitel: prof.MUDr Pavel Mareš, DrSc.
 
Status epilepticus (SE) má závažné funkční i morfologické důsledky, i když je vyvolán na časných vývojových stadiích pokusných zvířaf. Pomocí interhemisferických (transkalosálních) odpovědí jsme prokázali věkově závislé změny dráždivosti mozkové kůry po SE (Mareš et al. – přijato do tisku). V této práci jsme sledovali změny odpovědína rytmickou stimulaci – potenciaci nebo depresi těchto odpovědí.
Ve dvou věkovych skupinach mlaďat potkanů – 12 a 25 dnů starých (P12 a P25) jsme SE vyvolávali pilokarpinem (40 mg/kg i.p.) aplikovaným 24 hodin po injekci LiCl (3 meq/kg i.p.). Po 2 hodinách konvulsivní aktivity jsme křeče přerušovali injekcí paraldehydu (0.3 ml/kg). Kontrolní skupina nedostávala pilokarpin, ostatní procedura byla totožná s experimentálními skupinami. Stimulační a registrační epidurální elektrody jsme vhojovali 3 nebo 9 dní po SE. Sensorimotorickou oblast kůry jsme stimulovali pravoúhlými pulzy a registrovalí odpovědí na levé sensoromotorické kůře. Každé měření začínalo stanovením prahových intenzit pro jednotlivé odpovědi. Dvojnásobek této intenzity byl použit pro stimulace seriemi 5.pulzů s intervaly mezí stimuly 100, 125, 160, 200 nebo 300 ms. Zprůměrňovali jsme vždy 8 odpovědí a měřili amplitudu vrcholů první pozitivní a první negativní vlny v každé z pětí odpovědí. Amplituda druhé, třetí, čtvrté a páté odpovědi byla vztažena k amplitudě první odpovědi (ta představovala 100 %).
Frekvenční potenciaci odpovědí jsme nalezli u kontrolních zvířat ve skupině P12 po 3 dnech. Zvířata, u kterých byl vyvolán SE, vykazovala potenciaci pouze při intervalu mezi podněty 100 ms, naopak při intervalu 200 ms jsme zaregistrovali frekvenční depresi. Kontrolní zvířata skupiny P25 nevykazovala změny odpovědí při rytmické stimulaci, u potkanů po SE jsme nalezli frekvenční depresi odpovědí 3 i 9 dní po SE při použití interval 160 ms. V této studii jsme nenaleyli zvýšenou excitabilitu mozkové kůry, naopak dráždivost je přechodně snížena pravděpodobně jako důsledek korového poškození.
 
NOVÉ PRÍSTUPY V EXPERIMENTÁLNOM HODNOTENÍ BIOMECHANICKÝCH VLASTNOSTÍ CHRUPAVKOVÉHO TKANIVA.
Varga F.¹, Držík M.², Filová E.^1,3, Rampichová M.^1,3, Šimunová L.^1,3, Lytvynets A.³, Handl M.⁴, Amler E ^1,3. ¹Ústav biofyziky UK 2. LF, ²Medzinárodné laserové centrum Bratislava, ³Fysiologický ústav AV ČR, ⁴Ortopedická klinika FN Motol.
 
Chrupavkové tkanivo má v organizme predovšetkým nosnú a tlmivú úlohu, preto majú jeho mechanické vlastnosti zásadný význam. Pre biomechanickú charakteristiku materiálov sa využívajú hodnoty Youngovho modulu (E), Poissonovho čísla (ν) a ďalších veličín popisujúcich elasticitu materiálu.
Mechanické vlastnosti materiálov sa štandardne určujú v laboratórnych zariadeniach aplikovaním záťaže na vzroku uchytenú v svorkách meracieho prístroja. Takýto prístup je však u biologických vzoriek problematický najmä v dôsledku ich obmedzených rozmerov, prirozdenej vlhkosti a elasticity, ktoré komplikujú uchytenie.
Tieto nedostatky odstraňuje bezkontaktná metóda merania. Vo vyvinutej metóde bola vzorka v jednom bode uchytená vhodným lepidlom v špeciálne pripravenom miniatúrnom kartónovom rámiku. Adekvátna mechanická záťaž vzorku bola dosiahnutá zvukovým vlnením počuteľných frekvencií, ktoré vyvolalo kmitanie vzorku. Tento pohyb bol snímaný dopplerovským laserovým vibrometrom a vyhodnocovaný na PC. Mechanická odozva materiálu tak mohla byť kvantifikovaná hodnotami zrýchlenia, rýchlosti kmitania a jeho amplitúdy v závislosti na budiacej frekvencii. Tieto údaje slúžili pre výpočet hodnôt E a ν. Hodnoty dynamického E v úvodných meraniach boli rádovo 10⁶ Pa, priemerná hodnota ν bola 0,21±0,08 čo odpovedá hodnotám uvádzaným v literatúre. Potvrdil sa tiež zásadný vplyv vysychania vzorku na jeho elastické vlastnosti, tieto zmeny sa ukázali ako čiastočne reverzibilné. Uvedený spôsob merania nám tiež umožnil získať tzv. frekvenčnú charakteristiku skúmaného materiálu, komplexnejšie popisujúcu mechanické vlastnosti. Jej širšie využitie sa predpokladá pri kvalitatívnom zrovnávaní natívneho a vyvíjaného arteficiálneho elastického tkaniva chrupky, kde bude mať biomechanická charakteristika kľúčovú úlohu.
 
METODIKA IZOLACE ŽÍRNÝCH BUNĚK Z PLIC LABORATORNÍHO POTKANA
Vasiľková M., Malíková J., Ústav patologické fyziologie UK 2. LF
Školitel: MUDr. Hana Maxová Ph.D.,
 
Hypoxická plicní hypertenze (HPH) vzniká na podkladě remodelace periferních plicních cév. Na této přestavbě se podílejí tkáňové metaloproteinázy (1), jejichž bohatým zdrojem jsou žírné buňky. Bylo prokázáno, že žírné buňky v plicích zvířat vystavených hypoxii produkují ve zvýšené míře MMPs (2). Metodika izolace žírných buněk umožní studovat jejich podíl na vzniku HPH.
K izolaci jsme použili plíce ze 4 laboratorních potkanů km. Wistar o hmotnosti 330–370 g. Zvířata byla anestezována Thiopentalem i.p. 40 mg/kg, zaintubována a po otevření dutiny hrudní napojena na ventilátor. Po heparinizaci (2 ml) byla přes pravou komoru nakanylována plicnice a po rozstřižení levé komory byly plíce promývány roztokem PBS (infuzní pumpa, 4ml/100g/min). Po vynětí plic byla provedena opakovaná bronchoalveolární laváž (4–6 ml PBS). Plicní laloky byly odpreparovány od hilů a tkáň najemno nastříhána (1–2 mm).
Tkáň byla nejprve naštěpena trypsinem a poté hodinu inkubována s enzymatickou směsí (kolagenáza, hyaluronidáza, elastáza, DNAsa). Rozvolněné buňky byly přelity přes mikrosítko a v sérovém mediu stočeny rychlostí 2000 x g/ 10 min. Směs sedimentovaných buněk byla přidána do 4 ml PBS a nalita do kyvety s připraveným gradientovým Percollem (30 000 x g/ 30 min/ 7°C). Společně s kyvetou obsahující standardy byla centrifugována rychlostí 400 x g/ 30 min / 7°C. Pasteurovou pipetou byl odebrán prstenec odpovídající dle standardů denzitě 1,102–1,119 g/ml. Po vymytí z Percollu byly buňky obarveny trypanovou modří a v Bürkerově komůrce určena vitalita a počet. Histologické nátěry byly zafixovány metanolem a obarveny toluidinovou modří, v níž se granula žírných buněk barví metachromaticky.
(1) Novotná J., Herget J.: Physiol. Res. 51: 323–334, 2002.
(2) Maxová H. et al.: Physiol. Res 51: 69P, 2002.
Projekt je podporován grantem GAČR 305/03/P040.
 
VYUŽITÍ GENOMIKY PRO ZJIŠTĚNÍ KLÍČOVÝCH MOLEKUL U LEUKÉMIÍ
Vášková Martina^1,2, Mejstříková Ester^1,2, Kalina Tomáš^1,2, Trka Jan^1,3, Starý Jan³, Hrušák Ondřej^1,2. ¹CLIP-Childhood Leukemia Investigation Prague, ²Ústav imunologie, ³Klinika dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol.
Školitel: doc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D.; email: @email
 
Úvod: Podle expresních profilů (EP) dětských akutních lymfoblastických leukémií (ALL) vyšetřených Yeohem a spol (USA) vybíráme nové diagnosticky a prognosticky významné molekuly, které je možné detekovat průtokovou cytometrií (PC). Podle novější studie Caria a spol (SRN) vybíráme též molekuly korelující s odpovědí na léčbu. Převedení EP na přesnější a prakticky využitelné metody zpřesní informace o leukemických buňkách. Metody: Molekuly splňující předem stanovené podmínky vyšetřujeme u leukemických i nemaligních vzorků kostní dřeně pomocí vícebarevné PC. Solubilní formu CD44 (sCD44) jsme detekovali metodou ELISA. Výsledky: Prokázali jsme korelace předpovídané EP u molekul CD27(TNFRSF7) a CD44(Pgp-1) s TEL/AML1 genotypem (p<0.0001; n=56), ale nepotvrdili jsme vyšší expresi CD44 u pacientů s přestavěným MLL genem. Tito pacienti neměli ani vyšší hladinu sCD44 v plazmě kostní dřeně. Významně nižší hladinu sCD44 měli TEL/AML1^pos pacienti (p<0.0001; n=76). Výsledky pozorované u leukémie jsme přenesli do studia nemaligní krvetvorby. Naše výsledky naznačují, že nemaligní prekurzory B řady se dají podle dosud nepopisované exprese CD27 a CD44 rozdělit do diferenciačních stádií. Jiné molekuly (CD247 – zeta řetězec T buněčného receptoru, CD49f – integrin alfa6, IL-10RB – receptor pro interleukin-10, CD99 – MIC2) vyšetřujeme z pohledu odpovědi na léčbu (včetně minimální reziduální nemoci) a korelace s jinými genotypy. Exprese CD49f je vyšší u BCR/ABL^pos ALL (p=0.0432; n=35), podobně jako intenzita exprese CD99 (p=0.0003; n=114). 7 klíčových molekul vychází ze screeningu původních 400 molekul nejlépe korelujících podle EP. Závěr: Hrubou informaci o celkové genové expresi jsme rozšířili o stanovení exprese na vybraných subpopulacích maligních buněk. Klíčové molekuly popisujeme i v průběhu normální krvetvorby. Práce byla podpořena GA UK 80/2004, MSM0021620813, IGA MZ CR 7430-3.
 
STANOVENÍ GONADOTROPINŮ U PACIENTEK S JUVENILNÍ METRORRHAGIÍ A VLIV LÉČBY NA JEJICH HLADINY
Vetešníková-Koubová Radka, Gynekologicko-porodnická klinika UK 2. LF FN v Motole., Klinika gynekologie dětí a dospívajících UK 2. LF FN v Motole.
Školitel prof. MUDr. Jan Hořejší, DrSc.
Juvenilní metrorrhagie je poměrně častá porucha menstruačního cyklu vyskytující se nejčastěji do 2 let od menarche. V tomto období je s diagnozou juvenilní metrorrhagie léčeno a sledováno cca 3–5 % dívek. Porucha cyklu je na podkladě chronické anovulace, kdy je organismus dívky pouze pod vlivem estrogenů, tedy hyperestrinní stav. V momentě, kdy se organismus dostane do relativně hypoestrinního stavu, nastane dlouhé a často i silné krvácení. Léčba má základní body: akutní zástava krvácení se sekreční transformací děložní sliznice, úprava krevního obrazu, odlučovací krvácení a prevence recidiv.
Vzhledem k tomu, že se porucha vyskytuje prakticky vždy na počátku menstruačního stáří, jedná se pravděpodobně o nezralost zpětnovazebného systému osy hypotalamus-hypofýza-ovarium. Sledujeme proto aktuální hladiny gonadotropinů před zahájením léčby, za týden po aplikaci hormonálního nárazu, a pak s odstupem 30 dnů při ambulantní kontrole. Potvrzuje se, že hladiny folikulostimulačního hormonu jsou u pacientek zvýšeny a po léčbě akutního krvácení a při hormonální substituci druhé poloviny cyklu se normalizují.
 
EXPRESE GENŮ PAX2 A PAX8 V KONVENČNÍM TYPU SPORADICKÉHO RENÁLNÍHO KARCINOMU (RCC)
Viktorová T.(¹), Babjuk M.(²), Dušková J.(³), Mareš J.(¹) ¹Ústav biologie a lékařské genetiky, UK 2. LF Motol, ²Urologická klinika UK 1. LF, ³Ústav patologické anatomie UK 1. LF. Školitel prof. MUDr. Petr Goetz Csc.
 
Sporadický renální karcinom (renal cell carcinoma) patří mezi nejčastější nádorová onemocnění v dospělém věku (85 %). Česká republika zaujímá první místo na světě ve výskytu i úmrtnosti na tento typ nádoru, ale jeho incidence vzrůstá v poslední době i v ostatních průmyslových zemích. Pětileté přežívání pacientů s RCC nepřesahuje 70 % a jako hrubý prognostický ukazatel se používá TNM klasifikace a nukleární grading. Prognostika RCC je poněkud obtížná – celých 30 % pacientů má metastázy jež v době diagnosy a dalších 30 % recidivuje v různě dlouhé době po chirurgickém zákroku. RCC je velmi heterogenní a to geneticky i fenotypově. Podle Heidelberské klasifikace rozeznáváme čtyři histologické varianty RCC:
1) konvenční (také světloduňěčný – „clear cell“) – 65–75 %, 2) papilární – 10–15 %, 3)
chromofóbní – 5 % a 4) karcinom sběrných duktů – 1 %
Od konce roku 2002 bylo odoperováno celkem 90 pacientů (90 % souboru tvoří konvenční typ RCC). U 50 vybraných nádorových vzorků byla izolována mRNA a provedeno měření exprese genů PAX2 (10q22-24) a PAX8 (2q12-14) použitím metody relativní kvantifikace real-time PCR s GAPDH jako endogenní kontrolou. Analýza byla provedena na přístroji ABI Prism 7000.
Geny PAX2 a PAX8 kódují transkripční faktory ovlivňující vývoj ledviny v embryonálním stádiu. Jejich patologická overexprese v buňkách RCC souvisí se stimulací proliferace nebo/a inhibicí apoptotického programu. Předpokládá se, že exprese genů z rodiny PAX by mohla být vhodným a přesnějším prognostickým ukazatelem. Exprese PAX2 byla detekována v 94 % a exprese PAX8 v 89 % RCC souboru. Exprese genu PAX2 koreluje s velikostí nádoru (p=0,07). Pro zhodnocení prognostického významu je nutné pokračovat ve sběru dalších klinických dat. Tato práce je podporována grantem IGA MZ 7519-3.
 
DETEKCE AUTOREAKTIVNÍCH T LYMFOCYTŮ V PREDIKCI DIABETU 1. TYPU
Vrabelová Zuzana¹, Štechová Kateřina¹, Böhmová Kristýna¹, Chudoba Daniel², Faresjö Maria³, Zacharovová Klára⁴, Vavřinec Jan^1
1Pediatrická klinika UK 2. LF a FN Motol, ²Ústav biologie a lékařské genetiky UK 2. LF a FN Motol,³Division of Pediatrics and Diabetes Research Centre, Dpt. of Molecular and Clinical Medicine, Linkőping University,Švédsko, ⁴Klinika diabetologie Centra diabetologie IKEM; školitelé: prof. MUDr. Jan Vavřinec, DrSc., a MUDr.Kateřina Štechová, Ph.D.
 
Úvod: V patogenezi diabetu 1.typu hrají klíčovou roli autoreaktivní T-lymfocyty.Jejich přítomnost vede u vnímavých jedinců k destrukci beta buněk pankreatu a následné inzulinopenii. Převažující z hlediska cytokinového spektra je u diabetu Th1 typ buněčné odpovědi.
Cíl:Ověření, zda je možné v periferní krvi detekovat imunokompetentní buňky reaktivní proti známým diabetogenním autoantigenům.
Dosud vyšetřené osoby: 8 pacientů s čerstvým záchytem diabetu 1.typu v době diagnózy a s odstupem 6 měsíců, 8 prvostupňových příbuzných a 8 zdravých kontrol (poměr muži/ženy a věkové složení jsou srovnatelné).
Metodika: Nativní periferní krevní mononukleární buňky jsou stimulovány specifickými sekvencemi známých diabetogenních autoantigenů (Hsp, GAD65 a IA2, proinzulín). Pomocí proteinové microarray vyhodnocujeme spektrum produkovaných cytokinů po specifické stimulaci (Th 1 versus Th 2 resp.Th3 typ).
Závěr: U pacientů s čerstvou manifestací diabetu byla pozorována převaha Th1 cytokinové odpovědi, která souvisí s pozitivitou protilátek a přítomností rizikového genotypu. S odstupem 6 měsíců se cytokinový profil u pacientů mění.
U zdravých kontrol jsme neprokázali převahu Th1 cytokinového profilu po stimulaci specifickými autoantigeny. U jedné matky pacienta s diabetem jsme pozorovali výraznou produkci Th1 cytokinů. Je možné, že se jedná o projev dosud klinicky němé inzulitidy. Stanovení autoreaktivních T-lymfocytů je důležité zejména pro časnou diagnostiku, predikci a případně imunomudulaci diabetu 1.typu.
Finanční podpora IGA MZČR NR/8127-3.
 
VYŠETŘENÍ OČNÍCH POHYBŮ U PACIENTŮ S HEREDITÁRNÍMI ATAXIEMI
Vyhnálek M.¹, Jeřábek J. ¹, Černý R. ¹, Zumrová A. ², Brzezný R. ¹, Bojar M. ^1
1 Neurologická klinika dospělých, UK 2. LF a FN Motol, V úvalu 84, 150 00 Praha 5, Motol, ² Klinika dětské neurologie, UK 2. LF a FN Motol, V úvalu 84, 150 00 Praha 5, Motol
školitel doc. MUDr. J. Jeřábek CSc
 
Úvod: Hereditární ataxie jsou heterogenní degenerativní onemocnění s dominujícím postižením mozečku, mozečkových drah a mozkového kmene. Přesné určení genetického podkladu v posledních desetiletích umožnilo exaktní klasifikaci těchto chorob. V České republice jsou nejčastějšími dědičnými ataxiemi recesivní Fridreichova ataxie (FRDA) a dominatní spinocerebelární ataxie typu 1 a 2
Cílem pilotní studie bylo vypracování protokolu vyšetření očních pohybů u těchto onemocnění s ohledem na určení postižení mozečkových a kmenových struktur a jejich korelaci s genetickým postižením.
Metody: Sedm pacientů s geneticky čerstvě potvrzenou ataxií (4 pacienti s SCA 2, 2 pacienti s FRDA a 1 pacient s SCA 7) bylo kompletně vyšetřeno videookulograficky a elektronystagmograficky (spontánní a pohledový nystagmus, reflexní sakády, horizontální a vertikální optokinetický nystagmus (okn), plynulé sledovací pohyby (spn), sinusová rotace a kalorizace).
Výsledky: V okulomotorickém nálezu pacientů s SCA 2 dominovalo patognomonické snížení rychlosti sakád, které bylo v různé míře doprovázeno známkami postižení centrální části mozečku (časné narušení zejména vertikálního optokinetického nystagmu). Všichni pacienti měli též výraznou rotační i kalorickou hypo až areflexii. Relativní ušetření spn svědčí pro ušetření olivocerebelárního systému v časných fázích choroby. Pacienti s FRDA měli časné narušení okn, pseudopendulární nystagmus ve tmě, během progrese choroby se objevila též rotační a kalorická hypo až areflexie. Sledovací pohyby byly postiženy později, sakády byly v normě.
Pacient s pokročilou formou SCA 7 měl výraznou sakadickou hypermetrii, porušení sledovacích pohybů očních i okn bylo velmi mírné. Pacient měl též klinické známky bilaterální kalorické areflexie a četné sakadické intruze typu square wave jerks.
 
Podporováno z grantu IGA MZ ČR NM/7405-3 a NR 8124-3
 
RENÁLNÍ AKTIVITA AKT KINÁZY U MODELŮ DIABETU 1. A 2. TYPU (DM1 A DM2)
Ždychová J., Kazdová L., Pelikánová T. a Komers R. Centrum diabetologie, IKEM, Praha. Śkolitel MUDr. Radko Komers, CSc
 
Úvod: Akt je součástí buněčné signalisace insulinu a reguluje řadu funkcí např. metabolismus, buněčný růst a životnost. Působení insulinu v ledvinách může přispět k morfologickým a hemodynamickým změnám během DM. Cílem bylo studium aktivity a exprese Akt v kůře ledvin u modelů DM: obézních Zuckerových potkanů (ZDF), modelu DM2, streptozotocinových diabetických potkanů (STZ-DM), modelu DM1 a příslušných nediabetických kontrol stejného věku.
Metody: ZDF a stejně staré kontroly (Zucker lean, ZL), byli studováni ve věku 4 (ZDF4) a 12 týdnů (ZDF12). STZ-DM (Wistar) byli rozděleni do 3 skupin léčených 0j, 4j a 12j insulinu denně (STZ0, STZ4, STZ12) k zajištění různé hladiny glykémie a insulinemie a studováni po 3–4 týdnech trvání DM1. Aktivita Akt v byla měřena pomocí Akt kinásové eseje a dle exprese aktivní fosforylované formy ve vztahu k expresi celkového Akt proteinu a ubikvitérního proteinu aktinu (western blot). Hodnoty expresí jsou presentovány jako násobky exprese u kontrolních zvířat (C=1). Koncentrace insulinu v plasmě (P-Ins) byly stanoveny pomocí EIA.
Výsledky: Aktivita Akt byla zvýšena u ZDF12 ve srovnání se ZL (3.02±0.8, p<0.01 vs. ZL). Exprese P-Akt sledovala obdobný trend. Nárůst odpovídal nárůstu P-Ins. U DM1 byla nejvyšší aktivita Akt zjištěna u STZ4 (STZ0: 2.1±0.4; STZ4: 2.5±0.4; STZ12: 1.4±0.4 p<0.01 STZ4 vs. C). Na rozdíl od aktivity Akt, byla u STZ0 exprese P-Ser-Akt významně snížena (STZ0: 0.46±0.04; STZ4: 0.77±0.14; STZ12: 0.9±0.16, p<0.01 STZ0 vs. C, p<0.01 STZ12 vs. STZ0, p<0.05 STZ4 vs.STZ0) a odpovídala zjištěným P-Ins. U obou modelů DM nebyly zjištěny rozdíly v expresi celkové Akt.
Závěry: Paralelně s věkem a rozvojem metabolického syndromu byl u ZDF detekován nárůst Akt aktivity, což nesvědčí pro přítomnost IR v DM2 ledvinách. U DM1 byla nejvyšší aktivita Akt pozorována u kombinace středně těžké hyperglykemie a normoinsulinemie (STZ4). Exprese P-Ser-Akt, specifický ukazatel podílu insulinu na aktivaci Akt naznačuje, že u DM1 se na aktivaci systému podílí i jiné faktory než insulin.
 
DETEKCE PROTILÁTEK PROTI PROTEINŮM TEPELNÉHO ŠOKU 60 KD, 65 KD A 70 KD V SÉRECH PACIENTŮ S JUVENILNÍ IDIOPATICKOU ARTRITIDOU
Zlacká D ¹, Vavřincová P², Hromadníková I^1
1Laboratoř buněčné biologie, ²Dětská poliklinika, UK 2. LF a FN Motol. Školitel RNDr. Hromadníková Ilona, Ph.D.
 
Sekvenční homologie a zkřížená reaktivita mezi mikrobiálními a lidskými proteiny tepelného šoku (hsp) dokazuje, že hsp by mohly hrát roli v etiopatogenezi řady autoimunitních chorob. Zkoumali jsme protilátky proti rekombinantnímu lidskému hsp 60 (Ig celkově), Mycobacterium bovis hsp 65 (Ig celkově) a rekombinantnímu lidskému hsp 70 (Ig celkově, IgG a IgM) za použití vlastního ELISA testu u 209 pacientů (100 M/109 Ž) s juvenilní idiopatickou artritidou ve věku 2–56 let (medián 14, průměr 15.3). Soubor zahrnoval 83 pacientů s oligoartritidou, 109 pacientů s polyartritidou (97 RF pozitivních a 12 RF negativních), 17 pacientů se systémovým onemocněním a 50 zdravých kontrol ve věku 2–47 let (medián 23, průměr 22.2).
 
   
 

 
Prokázali jsme signifikantně nižší hladiny anti-hsp 60 a anti-hsp 65 protilátek (P < 0.001) a signifikantně vyšší hladiny anti-hsp 70 (Ig celkově, IgG a IgM) protilátek (P < 0.001) u JIA pacientů ve srovnáni se zdravými kontrolami. Nebyl pozorován žádný rozdíl mezi hladinami protilátek anti-hsp60, anti-hsp65 a anti-hsp 70 a přítomností ANA, HLA B27 a délkou onemocnění kromě signifikantně vyšších protilátek anti-hsp 70 (IgM) u HLA B27 pozitivních JIA pacientů. Zjistili jsme signifikantně vyšší anti-hsp 60, anti-hsp65 (Ig celkově) a anti-hsp70 (Ig celkově, IgG, IgM) protilátky u RF pozitivních JIA pacientů.
 
Tato práce byla podpořena grantem TRANSEUROPE, no. QLRT-2001-01936; Trans-net, no. MRTN-CT-2004-512253 a VZ 111300005.
 
PROTILÁTKY PROTI PROTEINŮM TEPELNÉHO ŠOKU 60 KD, 65 KD A 70 KD V SÉRECH PACIENTŮ PO TRANSPLANTACI HEMATOPOETICKÝCH BUNĚK
Zlacká D¹, Sedláček P², Hromadníková I^1
1Laboratoř buněčné biologie, ²Klinika dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol.
Školitel RNDr. Hromadníková Ilona, Ph.D.
 
Mnoho tvrzení dokazuje, že proteiny tepelného šoku (hsp) hrají důležitou roli v patogenezi nemoci štěpu proti hostiteli (GvHD). Pomocí vlastního ELISA testu jsme detekovali protilátky proti rekombinantnímu lidskému hsp60, Mycobacterium bovis hsp65 a rekombinantnímu lidskému hsp70 (Ig celkově, IgG a IgM) u dětí po transplantaci hematopoetických kmenových buněk pro různá maligní i nemaligní onemocnění. Do studie bylo zahrnuto 21 pacientů (16 M/5 Ž) ve věku 1–18 let (medián 8, průměr 9.52) se základními diagnosami: MDS (n = 3), CML (n = 2), JMML (n = 1), ALL (n = 6), AML (n = 2), SAA (n = 2), SCID (n = 1), WAS (n = 2), MPS n = 1) a MF (n = 1). Pacienti byly léčeny transplantací PBSC (n = 10), kostní dřeně (n = 10) nebo pupečníkové krve (n = 1) od nepříbuzenských dárců (n = 17) nebo HLA identických sourozenců (n = 4). Pacienti měli různé přípravní režimy: CTO/Etoposid (n = 4); CTO/Cy (n = 2); CTO/Tiotepa/Fludarabin (n = 1); CTO/Fludarabin/Cy (n = 1); Bu/Cy (n = 4); Bu/Cy/Mel (n = 5); Bu/Cy/Etoposid (n = 2); ALG/Cy (n = 1); Flu/Mel (n = 1). GvHD profylaxe obsahovala CsA/MTX (n = 4); CsA/MTX/ATG (n = 14); CsA/MP/ATG (n = 1); CsA/MMF/MTX/Prednison (n = 1) nebo CsA/ATG (n = 1). 13 pacientů mělo akutní GvHD stupně II a dobře odpovídali na léčbu kortikosteroidy. U pěti z nich se GvHD později reaktivovala. 5 pacientů nemělo žádné známky akutní GvHD. Jeden pacient měl steroid-resistentní aGvHD stupně III a dva pacienti steroid-resistentní aGvHD stupně IV.
Anti-hsp protilátky byly detekovatelné před zahájením přípravného režimu, během přípravného režimu a po celou dobu po transplantaci včetně časné fáze. Nepozorovali jsme žádnou změnu hladin protilátek anti-hsp60, anti-hsp65 a anti-hsp70 (Ig celkově, IgG a IgM) v době manifestace nebo reaktivace aGvHD. Protilátky proti proteinům tepelného šoku 60 kD, 65 kD a 70 kD nejsou asociováni s akutní GvHD. Další studie budou zaměřeny na asociaci protilátek proti proteinům tepelného šoku s chronickou GvHD.
 
Práce byla podpořena grantem TRANSEUROPE, no. QLRT-2001-01936 a VZ 111300005.