Doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D., obdržel Cenu ministra zdravotnictví za zdravotnický výzkum a vývoj a prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D., a MUDr. Ester Mejstříková, Ph.D., obdrželi čestná uznání. Každoročně se uděluje pět ocenění v obou těchto kategoriích, a to na návrh odborných hodnotících panelů Agentury pro zdravotnický výzkum (AZV) ČR. Seznamte se s pracemi obou vědců a pedagogů z Kliniky dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol.
Prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
Prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D., studoval na Fakultě dětského lékařství a promoval v roce 1991 již na 2. lékařské fakultě. Po absolvování základní vojenské služby odešel v roce 1992 do německého Göttingenu, kde pracoval rok na neuropediatrické klinice a další rok na ústavu lidské genetiky. Pak ještě pracoval na přelomu let 1994–95 a 1996–97 vždy půl roku v neurogenetické laboratoři prof. A. Rolfse v Berlíně a v Rostocku.
Od roku 1995 pracuje na Klinice dětské neurologie 2. LF kde od roku 1997 vybudoval postupně DNA laboratoř. Atestoval nejprve z pediatrie a následně z lékařské genetiky a pak i z dětské neurologie. V DNA laboratoři s podporou grantů zavedl pro ČR nejprve diagnostiku dědičných neuropatií (Charcot-Marie-Tooth) a později i dalších neurologických onemocnění jako leukodystrofie Pelizaeus Merzbacher nebo mikrocefalie – syndromu Seemanové II, nyní již Nijmegen breakage syndromu (NBS), CCFDN syndromu u Romů a další. Se svým týmem pak v roce 2002 zavedl i DNA diagnostiku dědičné nesyndromové hluchoty v ČR a od roku 2004 i hereditární spastické paraparésy a pak některých specifických genetických onemocnění u českých Romů a od roku 2015 i DNA diagnostiku časných a závažných dětských epilepsií a epileptických encefalopatií pomocí NGS panelů genů, také díky grantu Ministerstva zdravotnictví, který získal letos ve velké konkurenci projektů čestné uznání za výsledky.
Prof. Pavel Seeman byl školitelem celkem osmi doktorandek, které úspěšně obhájily, a některé z nich již školí své doktorandy. Prof. Seeman byl za 22 let hlavním řešitelem celkem 11 grantů MZ ČR, z nichž tři byly oceněny čestným uznáním ministra, a byl navíc spoluřešitelem dalších šesti grantů MZ ČR.
Využití masivně paralelního sekvenování panelu genů spojených s dětskou epilepsií
a epileptickou encefatopatií pro diagnostiku příčin epilepsie v ČR
Řešitel: Prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
Spolupracovníci:
MUDr. Petra Laššuthová, Ph.D.
MUDr. Katalin Štěrbová
MUDr. Markéta Vlčková, Ph.D.
Ing. Lucie Sedláčková, Ph.D.
Ing et Ing David Staněk
RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D.
prof. MUDr. Pavel Kršek, Ph.D.
Cílem projektu bylo využít nové genetické vyšetřovací metody – masivně paralelní sekvenování (MPS) pro efektivní a ekonomickou diagnostiku a objasňování příčin závažných a časných dětských epilepsií a epileptických encefalopatií (EE) u pacientů v ČR. Vyšetřením 50–200 pacientů zjistit u kolika z nich a u kterých lze najít příčinu EE pomocí MPS panelu 112 genů a o jaké příčiny a geny jde.
EE jsou závažným onemocněním, které se projevuje epileptickými záchvaty brzy po narození a způsobuje opoždění či zástavu vývoje nebo i zhoršení. Většinou jde o izolované případy v rodině a příčina těchto závažných onemocnění dětí zůstávala v minulosti až na naprosté výjimky neobjasněná a většinou zcela neznámá, což ve většině rodin vedlo k velkým obavám z rizika opakování u dalších potomků.
Nové metody molekulární genetiky, zejména MPS, umožnily zásadní objevy mnoha genů, jejichž porucha může být příčinou EE. MPS umožňuje vyšetření mnoha (stovek i tisíců) genů současně nebo i celého genomu a zjištění všech odchylek od „normy“ nebo i zjistit mutace vzniklé nově (de novo) u dítěte a nepřítomné u rodičů. Tyto de novo mutace v genech, kódujících iontové kanály neuronů mozku, jsou hlavní a nejčastější příčinou EE. DNA diagnostika EE nebyla v ČR před naším projektem dostupná.
Realizací našeho projektu s podporou AZV se zvýšila úroveň genetické i neurologické diagnostiky na úroveň nejvyspělejších zemí a našim pacientům a rodinám je nyní i ČR k dispozici nejmodernější diagnostika, kterou bylo dříve třeba hledat jen v zahraničí. Díky podpoře AZV jsme vyšetřili pomocí MPS panelu genů nebo i celoexomovým sekvenováním 227 českých pacientů s nejasnou příčinou časné a závažné epilepsie a objasnili jsme příčinu onemocnění u 66 z nich (29 %) a u pacientů, u kterých se epileptické záchvaty objevily již v novorozeneckém věku – do 6. týdne života – se podařilo příčinu objasnit u až 69 % z nich. Zjistili jsme, že příčinou EE u českých pacientů jsou v převážné většině – až u 90 % objasněných pacientů – de novo vzniklé mutace, což je zásadní pro určení rizika opakování onemocnění u příbuzných, které v těchto případech není zvýšeno. Příčinné mutace jsme nalezli v celkem 30 různých genech a jen ve 14 genech jsme nalezli příčinu opakovaně a nezjistili jsme gen, kde by byly příčinné mutace výrazně častěji (nad 3 % z vyšetřených pacientů). Geny, ve kterých jsme příčinu EE našli opakovaně, byly: SCN1A, KCNQ2, WDR45, SCN8A a STXBP1. Vytvořili a ověřili jsme vyhodnocovací postup pro vyhodnocení dat z MPS panelu genů a z celoexomového sekvenování a zavedli jsme tyto postupy do diagnostiky v ČR. Zásadní pro efektivní diagnostiku se ukázalo mít k dispozici dostatek klinických informací, provádět pečlivý a expertní výběr pacientů k vyšetření a mít již před vyšetřením k dispozici DNA od obou rodičů. Objasnění příčiny EE má velký přínos a význam pro pacienty, rodinu i pro společnost, protože ukončí tzv. diagnostickou Odysseu, nepokračuje další zbytečné vyšetřování a hospitalizace, v 90 % objasněných případů je možné sdělit příznivou prognózu pro další děti a příbuzné a pro řadu z objasněných pacientů je možné vybrat nejvhodnější léčbu.
Doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D.
Absolvoval Všeobecné lékařství a doktorské studium na 2. lékařské fakultě. Po ukončení doktorského studia odešel jako postdok do Fred Hutchinson Cancer Research Center v USA, kde se zabýval rekonstrukcí imunity pro transplantaci kostní dřeně. Nyní působí jako vedoucí projektu na Klinice dětské hematologie a onkologie. Zabývá se imunodeficity, lymfocytárním vývojem a novými technologie v cytometrii. Je členem výboru několika mezinárodních odborných společností (International Society for Advancements of Cytometry, Human Cell Differentiation Molecules). Letos získal Cenu ministra zdravotnictví za zdravotnický výzkum a vývoj.
Dysregulace imunitního systému: vlastnosti lymfocytů u pacientů s immunodeficiencí a autoimunitními projevy
V projektu jsme se zabývali pacienty s primárními imunodeficiencemi (PID). Ti trpí poruchami imunitního systému, který nedostatečně reaguje na infekce, a zároveň u nich v některých případech selhává kontrola a celková rovnováha imunitní reakce. Dysregulovaný imunitní systém pak vyvolává alterovanou reakci, často autoimunitní, namířenou proti vlastnímu organismu. Projekt byl řešen v úzké spolupráci 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy, Fakultní nemocnice v Motole v Praze a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně.
Naším cílem bylo pomocí výzkumných metod (mnohoparametrové průtokové cytometrie a genového sekvenování nové generace) charakterizovat vlastnosti lymfocytů pacientů s PID a využít tyto informace pro sestavení diagnostického postupu. Účinek nově zjištěných genetických mutací na funkce lymfocytů jsme potom charakterizovali pomocí testů imunitní funkce in vitro. Hledali jsme též způsoby identifikace léčebných cílů pro přístupy personalizované medicíny, kdy se nám podařilo vytvořit cytometrické monitorování účinku vybraných cílených léčiv (léčebný efekt inhibitorů Jak/Stat dráhy u pacienta s aktivační mutací STAT1).
Ve své vymezené oblasti bádání jsme propojili výsledky vědecké (mutace lidských genů u pacientů poskytují informaci o roli daného genu) s tvorbou nových diagnostických postupů. Celkem jsme publikovali deset mezinárodních článků (celkový impakt faktor 55), pracovali jsme v rámci evropského konsorcia EuroFlow a podíleli jsme se na vývoji diagnostického testu, který je nyní komerčně dostupný. Spolupracující pracoviště zároveň úspěšně vychovávají budoucí odborníky v rámci Ph.D. studia a budují vědomostní, diagnostickou, odbornou, logistickou a léčebnou základnu pro léčbu PID. Pacienti s PID v České republice tak dostanou nejmodernější diagnostickou a následně léčebnou péči na Evropské úrovni.
Doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D, hlavní řešitel projektu (2. LF UK, Praha)
Prof. MUDr. Anna Šedivá, DSc., spoluřešitelka (FN Motol, Praha)
Mgr. Marcela Vlková, Ph.D., spoluřešitelka (FN u sv. Anny, Brno)
MUDr. Ester Mejstříková, Ph.D.
Po absolvování Všeobecného lékařství na 1. lékařské fakultě si vybrala 2. lékařskou fakultu pro své doktorské studium na Ústavu imunologie. Nyní zde působí jak vědecká pracovnice a vedoucí projektu na Klinice dětské hematologie a onkologie. Předmětem jejího zájmu je plasticita leukemických buněk v kontextu normální krvetvorby a selháni kostní dřeně v dětském věku. V roce 2015 získala cenu Discovery Award pro mladé výzkumníky do 40 let. Čestné uznání ministra zdravotnictví pro nejlepší ukončený grant získala jako jediná žena.
Fenotypová plasticita leukemických buněk a její genetický podklad – vztah k terapii a detekci minimální reziduální nemoci
Akutní leukémie jsou nádorová onemocnění vznikající maligní transformací buněčných prekurzorů krvetvorby v různých fázích vývoje. Dělíme je na dvě základní podskupiny s odlišnou strategií léčby: akutní myeloidní (AML) a akutní lymfoidní leukémii (ALL). Oba subtypy rozlišíme především při morfologickém a imunologickém vyšetření. Incidence AML stoupá s věkem a je relativně vzácná v dětském věku. ALL je naopak častějším subtypem u dětí. Prognóza AML u dětí je obecně horší než ALL. U většiny pacientů nebývá problém rozlišit obě formy, přesto pro mezinárodní studie bylo třeba vyvinout jednotné guidelines i laboratorní a interpretační postupy zajišťující vzájemnou porovnatelnost dat. U asi 4 % leukémií nejsou nálezy v diagnóze zcela jednoznačné pro myeloidní, resp. lymfoidní linii a tyto leukémie nazýváme jako leukémie smíšeného fenotypu (mixed phenotype leukemia – MPAL) nebo leukémie nejasné linie (acute leukemia of ambiguous lineage – ALAL). V rozsáhlé mezinárodní studii jsme prokázali u těchto pacientů lepší prognózu, pokud byli léčeni lymfoidními léčebnými protokoly. Oblastí zájmu naší skupiny je tzv. přesmyk z lymfoidní do myeloidní linie v průběhu časné fáze léčby ALL. V extrémní podobě během prvního týdne léčby dojde k dramatické změně lymfoidního fenotypu na fenotyp připomínající AML. V roce 2014 jsme popsali asociaci s aberantní expresí antigenu CD2 (LFA-2) a delecí genu ERG, která ale nebyla přítomná u všech pacientů s tímto fenoménem. Fenomén přesmyku představuje extrémní formu liniové plasticity a dosud jsme nebyli schopni identifikovat genetické aberace zodpovědné za přesmyk. V posledních letech se masivně rozvíjejí celogenomové metody, zejména sekvenování RNA (RNA-seq), umožňující identifikaci dosud nepopsaných mutací nejen v hematoonkologii. Prokázali jsme, že u pacientů s přesmykem do myeloidní linie asi v 70 % nacházíme aberaci genu DUX4. Pomocí RNA-seq jsme prokázali zvýšenou expresi genu CLEC12A (CLL-1, CD371) a posléze jsme prokázali zvýšenou expresi i na proteinové úrovni pomocí průtokové cytometrie. Jeden znak tedy dokáže identifikovat většinu pacientů s přesmykem. I přes dramatickou změnu fenotypu do myeloidní linie se ukazuje jako efektivní pokračování v léčbě dle ALL protokolu. V minulosti mohlo docházet k přeřazování těchto pacientů do myeloidních protokolů a částečně se mohli tito pacienti ztrácet ze sledování. V průběhu přesmyku dochází ke ztrátě lymfoidních znaků včetně antigenu CD19. V současné době jsou dostupná léčiva cílící na molekulu CD19 (blinatumomab, CAR-T buňky), a je tedy zásadní znát před zahájením této léčby, zda došlo nebo nedošlo ke ztrátě této molekuly, zároveň liniový přesmyk do myeloidní linie může vzniknout v průběhu anti-CD19 léčby. Výrazná změna fenotypu je i komplikací detekce tzv. minimální reziduální nemoci (MRN) v průběhu terapie a v rámci mezinárodní spolupráce jsme definovali postupy, jak maximálně zvýšit citlivost a výpovědní hodnotu detekce MRN pomocí průtokové cytometrie.
