Krevní buňky budeme měřit „spektrálně“

Hyperspektrální cytometr, který na pohled připomíná větší kávovar, je dalším špičkovým zařízením v cytometrickém týmu laboratoří CLIP na Klinice dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol.  Doplní nedávno instalovaný hmotnostní cytometr, a rozšíří tak dále výzkumné i diagnostické možnosti v oblasti buněčných analýz, probíhající na tomto pracovišti. Pořízen byl v rámci projektu CLIP: Hyperspektrální cytometrie s reg. č. CZ.2.16/3.1.00/24505, který je spolufinancován z Operačního programu Praha – Konkurenceschopnost (OPPK). Nový přístroj představuje v rozhovoru doc. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D., hlavní řešitel projektu.

K čemu konkrétně budete přístroj využívat? Převáží základní výzkum, nebo klinická diagnostika?

Přístroj bude mít úlohu jakéhosi průzkumníka, bude pronikat na hranici našich možností a posouvat je. V problematice imunitních dysregulací bude plnit obě role, výzkumnou i diagnostickou. Zvláště u vzácných dědičných poruch imunity provádíme vlastně diagnostiku výzkumem a výzkum diagnostikou. Pokud diagnostikujeme poruchu, která byla popsaná u několika desítek osob na světě (anebo se nám podaří odhalit poruchu dosud nepopsanou), pak postupujeme experimentálními metodami i v diagnostickém procesu. Zároveň musíme rozšiřovat naše znalosti o tom, co je vlastně normální, abychom dokázali naše zjištění interpretovat. Publikací obou těchto zjištění (takto funguje imunitní systém normálně a k této abnormalitě vede porucha nalezená u diagnostikované rodiny), přispíváme k základním znalostem o imunitním systému, a tedy k základnímu výzkumu. Čili základní výzkum a klinická diagnostika se nepřetlačují, ale jejich kombinací vniká nová kvalita s přínosem pro pacienty současné i budoucí a pro obecné „vědění“. Tato diagnostika výzkumem je možná jen díky kvalitní práci našich kolegů v ambulancích a u lůžek pacientů (v Motole existuje tzv. Imunodeficientní skupina zahrnující imunology, hematology, transplantology i pediatry). Zároveň těžíme z rozsáhlé sítě formálních i neformálních kontaktů po celé Evropě.

Co je největším přínosem nového přístroje?

Hyperspektrální cytometrie přináší revoluční změnu na poli průtokové cytometrie, a to tím, že na místo několika předdefinovaných vlnových délek (jeden detektor na jednu barvu) detekuje celé emisní spektrum vzorku. Výsledkem je větší počet měřitelných markerů (v současnosti až 20 při použití pouhých 3 excitačních laserů), výrazně větší flexibilita experimentálního designu, možnost měření exotických fluorochromů, ale také větší citlivost měření při zachování možnosti použití všech reagencií a postupů dostupných v tradiční cytometrii. Tyto vlastnosti jsou užitečné zejména k popisu imunitních dysregulací, kde je narušená „souhra“ buněk imunitního systému. Zajímavostí je, že hyperspektrální cytometr Sony SP6800 vyrábí japonská firma Sony, kterou dosud známe především díky výrobkům špičkové spotřební elektroniky

Na jakém principu zařízení pracuje?

Hyperspektrální cytometrie detekuje celé emisní spektrum analyzovaného vzorku (tedy smíšený signál z více fluorochromů najednou) pomocí multi-anodového fotomultiplikátoru. Pro každou buňku tak vzniká spektrální otisk, který je dále analyzován. Tato myšlenka není nová, ale teprve současné pokroky ve vývoji vysoce citlivých fotomultiplikátorů umožnily vytvoření dostupného systému. Spektrální otisk jednotlivých buněk je poté rozložen na signály jednotlivých fluorescenčních molekul. Tato metodika umožňuje jednak výrazně větší počet měřených markerů, ale přináší také výrazný pokrok v přesnosti – počet měřených oblastí emisního spektra je vždy větší než počet fluorochromů, a rozklad signálu je tak přeurčen. Je tedy možné spočíst autofluorescenci buněk nebo jakýkoli jiný signál nepocházející z použitých fluorochromů a provést příslušnou korekci. Tato technologie přináší také výrazně větší flexibilitu experimentálního designu (při zachování možnosti použití všech reagencií a postupů tradiční cytometrie), díky schopnosti odlišit signál z fluorochromů s podobným emisním spektrem, které by tradiční cytometrie odlišit nedokázala (což samozřejmě limitovalo jejich použití v experimentu).

V čem se v kontextu práce vaší laboratoře a výzkumných témat, kterými se zabýváte, liší nedávno pořízený špičkový hmotnostní cytometr a nejnovější hyperspektrální?

Hyperspektrální cytometrie nedávno pořízený přístroj využívající principů hmotnostní cytometrie doplňuje o možnost flexibilnějšího návrhu experimentů. Průtoková cytometrie se stala klíčovým nástrojem pro výzkum poruch krvetvorby zejména díky své schopnosti měřit současně mnoho parametrů na jednotlivé buňce. Jak se porozumění problematice prohlubovalo, rostl i počet markerů, které je užitečné měřit. Kromě standardního určování fenotypu (tj. identita buňky) průtoková cytometrie přichází ke slovu při monitorování odpovědi na léčbu (měření změn na buňce v odpovědi na terapeutikum) nebo při výzkumu signalizačních drah (co buňka zrovna vykonává). Dá se tedy očekávat, že v blízké době budou cytometrické testy rutinním postupem personalizované medicíny. Všechny tyto pokroky vedou k poptávce po větším počtu měřitelných signálů. Ačkoli jsou současné průtokové cytometry schopny měřit současně až 17 fluorescenční markerů, existují výzkumné otázky, u kterých je třeba měřit parametrů více. I když je možné rozdělit vzorek na několik částí a na každé analyzovat jinou množinu znaků, má toto řešení podstatná omezení – není možné získat celkový obraz všech znaků a vzhledem k tomu, že počet takových výběrů roste exponenciálně s počtem analyzovaných znaků, stává se rychle nepoužitelným kvůli finanční i časové náročnosti a množství materiálu, např. krve, který by bylo třeba analyzovat.

Je využití dvou takových přístrojů v rámci jedné laboratoře běžné? V čem je výhodné a co vašim laboratořím umožní?

V Evropě víme zatím o pracovišti ve Francii a ve Švýcarsku, kde integrují obě tyto nové technologie. Jejich kombinace umožňuje řešení otázek základního výzkumu a diagnostiky, které dosud nebylo možné metodicky uchopit. Naším cílem je lépe charakterizovat a pochopit funkci a vývoj imunitního systému a navrhnout přesnější a spolehlivější diagnostické postupy vedoucí k efektivnější péči o pacienty. Jelikož krevní buňky hrají zásadní roli jak v onemocněních krvetvorby, kterými se zabývá hematologie (poruchy tvorby krvinek anebo jejich nekontrolované množení), tak v poruchách imunity (porucha funkce imunitních buněk), je využití těchto technologií přínosem jak pro hematologii, tak i pro imunologii.

Budete produkovat ještě větší objemy dat. Nebude limitem využití špičkových přístrojů jejich zpracování?

Přístroj je vybaven softwarem, který transformuje hmotnostně spektrometrická data do standardního formátu průtokové cytometrie. To výrazně usnadňuje analýzu dat, pro kterou je tak možné použít některých ze standardních analytických platforem. Pro bioinformatickou analýzu je v podstatě jedno, jak data vzniknou, ale důležité je, abychom v těch velmi komplikovaných datech dokázali najít správné odpovědi. K tomu nám pomáhá i náš bioinformatický tým.

Jak dlouho trvá, než přístroje, nyní technologická špička, zastarají?

To samozřejmě nevíme, předpokládá se, že morální životnost těchto přístrojů je zhruba jedna dekáda. Doufám, že alespoň po tu dobu přístroje vydrží fungovat, ale může se stát, že za pět nebo sedm let přijde nová, revoluční technologie, která všechno změní.

Co se stane se staršími přístroji? Nahradí je zcela ty nové, nebo se najde místo pro všechny?

V našich laboratořích fungují stále i ty nejstarší přístroje z devadesátých let, každému přístroji dáváme takové úkoly, které dokáže splnit. Výhodou zavedených technologií je často jejich robustní fungování i rozsáhlá báze zkušeností a referenčních dat získaných za desetiletí práce.